Ⅰ. 서 론
부적절한 혈당 수치의 상승에 따른 당뇨병은 한국을 포함한 전 세계적으로 가장 중요한 대사성 질병 중 하나이며, 당뇨병 환자의 수는 지속적으로 증가할 것으로 예상된다1,2. 세포 내 항산화 시스템의 기능 감소 및 과도한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 의한 산화적 스트레스(oxidative stress)는 당뇨병 발병과의 상관성이 매우 높다3,4. 또한 당뇨병과 밀접한 연관성을 가지는 합병증 중의 하나가 당뇨병성 골다공증이며, 고농도의 포도당(high glucose)는 ROS 생성 요인으로 작용하여 광범위한 혈관 손상과 함께 뼈 흡수 증가와 뼈 형성 감소에 따른 뼈 대사 변화로 인해 뼈의 무기질 함량이 감소되어 당뇨병성 골다공증이 발생하며 이는 골절위험의 증가로 이어진다4-6. 뼈는 조골세포와 파골세포에 의한 뼈의 형성과 흡수가 지속적으로 전환되는 역동적인 광물 결합 조직이다. 파골세포의 과도한 활성화 또는 조골세포 활성의 억제에 따른 뼈 회전율의 불균형은 골량 감소에 의한 골다공증과 같은 심각한 장애를 유발할 수 있다7,8. 특히 고농도의 포도당에 의한 산화적 스트레스는 조골세포의 분화 억제와 세포사멸에 의한 조골세포의 손실 증가로 이어진다5,9. 현재 사용 중인 골다공증 예방과 치료에 적용하는 약물은 뼈 흡수를 억제하여 골량을 유지하고자 하는 것을 주요 목표로 한다. 하지만 이러한 약물들의 장기간 투여로 인한 부작용인 심장질환과 암 발생률 증가는 해결해야 할 과제이다10,11. 따라서 당뇨병성 골다공증에서 조절 장애가 있는 새롭고 중요한 유전자를 탐색하고 고농도의 포도당에 의한 조골세포 조절 장애의 분자생물학적 기전을 설명하는 것은 이 질병에 대한 잠재적인 치료법의 개발에 도움이 될 것이다. 조골세포 분화 및 뼈 형성 유전자 발현은 Runt-related transcription factor-2(Runx2) 및 Osterix(Osx)와 같은 핵심 전사 인자들에 의하여 엄격하게 조절되며, 골격 성숙도 및 뼈 회전율에 큰 영향을 미친다12,13. 더욱이 Runx2는 alkaline phosphatase(ALP), osteopontin(OPN)과 osteocalcin (OCN)을 포함한 골세포 특이적 유전자의 발현을 증가시켜 조골세포의 분화 및 뼈의 무기질화를 강화시킨다12,14. 이와 동시에 phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt(protein kinase B) 신호계를 포함한 조골세포의 환경을 둘러싼 세포 내·외 신호계의 활성 또한 조골세포의 생존 및 분화와도 밀접한 상관성을 가진다15,16. 뼈의 건강에 미치는 영향에 대한 많은 선행 연구들에서 고농도의 포도당은 뼈 형성 관련 유전자의 발현을 저해함으로써 조골세포 활동을 억제하며, 이는 산화적 스트레스와 연관성이 매우 높음을 보여주었다17,18. 따라서 골다공증 및 뼈 질환에 대한 치료에 자유 라디칼의 생성과 제거를 위해 부작용이 없으면서 항산화력이 우수한 천연 항산화제의 적용은 새로운 치료 표적이 될 수 있다.
층층나무과에 속하는 산수유 나무의 열매인 산수유(山茱萸)는 강장제, 혈액순환 촉진제로서뿐만 아니라 간과 신장에 영양을 공급하고 당뇨병과 기타 질병을 치료하는 데 사용되어 왔다19,20. 한의학에서 산수유는 수삽지제(收澁之劑) 중 하나로 보익간신(補益肝腎), 수렴고삽(收斂固澁)의 효능이 있으며21, 음(陰)을 강하게 하고 정(精)을 보하며, 신기(腎氣)를 보하고 정수(精髓)를 채워, 육미지황환(六味地黃丸), 공진단(拱辰丹), 고본건양단(固本健陽丹) 등의 처방에 들어가 보신자음(補腎滋陰), 전정보혈(塡精補血), 익기양신(益氣養神)의 기능이 있다22. 산수유 추출물과 활성 성분의 약리학적 활성은 항산화 잠재력과 밀접한 연관성이 있음이 많은 선행 연구에서 보고된 바 있다23-26. Yin 등27에 의하여 산수유 추출물이 파골세포 형성 억제에 대한 가능성이 처음 제시된 이후, 여러 선행 연구에서 산수유 추출물은 뼈의 형성을 유도하면서 소실은 차단할 수 있음이 밝혀져 골다공증 억제제로서의 유용성이 대두된 바 있다28,29. 그러나 산수유 추출물의 이러한 효과가 산화적 스트레스 억제와 연관된 것인지에 대한 연구뿐만 아니라 고농도의 포도당 환경에 노출된 조골세포의 분화 억제에 대한 산수유의 효능 평가는 이루어진 바 없다. 따라서 본 연구의 목적은 이러한 모델을 이용하여 당뇨병성 골다공증에 대한 산수유 열매의 에탄올 추출물(ethanol extract of Corni Fructus, EECF)의 효과를 평가하는 것이다. 이를 위하여 MC3T3-E1 조골세포 유사 세포를 이용하여 고농도의 포도당에 의한 산화적 스트레스에 의해 유도되는 세포독성과 조골세포 분화 억제에 대한 EECF의 억제 효과를 평가하였다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. EECF의 제조
본 연구에 사용된 산수유 열매는 구례시(Gurye City, Jeollanam-do, Republic of Korea) 주변 지역에서 수집된 것으로서 구례산수유영농조합법인(Gurye Sansuyu Farming Association Corporation)에서 구입하였다. EECF를 제조하기 위해 건조된 산수유 열매(20 g)를 작은 조각으로 자르고 70% 에탄올 400 mL로 4 ℃에서 3시간 동안 3회 추출하였다30. 여과 후 진공회전증발기(EYELA SB-1000, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하였으며, 잔여물(EECF)을 동결 건조기(Freeze dryer, SP Industries, Inc. Warminster, PA, USA)를 사용하여 건조한 후 실험에 사용하기 전 -80 ℃에 보관하였다.
2. 세포배양 및 EECF 처리
MC3T3-E1 세포(murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cell line)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 세포배양을 위하여 10%의 fetal bovine serum 및 1%의 penicillin-streptomycin 용액을 포함하는 α-Modification of Eagle’s Minimum Essential Medium을 사용하였다. 세포배양에 사용된 재료들은 모두 WELGENE Inc.(Gyeongsan, Republic of Korea)에서 구입하였으며, MC3T3-E1 세포는 5% CO2 및 37 ℃ 조건의 배양기에서 배양하였다. EECF를 세포에 처리하기 위해서는 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 최종 농도가 100 mg/mL(extract stock solution)가 되도록 한 후 4 ℃에서 보관하거나, 이를 세포배양 배지에 적정 농도로 희석하여 처리하였다.
3. 세포 생존율 분석
고당에 의한 MC3T3-E1 세포의 증식에 미치는 EECF의 적정 처리 농도 설정을 위하여 MC3T3-E1 세포를 6-well plates(4×104 cells/mL)에 분주하고 세포를 안정화시키기 위하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 다양한 농도의 EECF 및 포도당이 함유된 배지로 교체하여 24시간 동안 배양하거나, EECF가 함유된 배지에 1시간 배양된 세포에 포도당을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 처리가 완료된 MC3T3-E1 세포의 세포 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 분석을 사용하여 측정하였으며, 제조사가 제시한 실험 방법에 준하여 형성된 formazan crystal을 dimethyl sulfoxide(DMSO, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에 녹인 후, 540 nm에서 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 실험군별 흡광도를 검출하였다.
4. 세포독성 평가
고당에 의한 MC3T3-E1 세포의 세포독성 유발에 미치는 EECF의 영향을 분석하기 위하여 lactate dehydrogenase(LDH) 분석을 실시하였다. 이를 위하여 Abcam, Inc.(Cambridge, MA, USA)에서 구입한 LDH Assay kit를 사용하였으며, EECF가 있거나 없는 배지에서 MC3T3-E1 세포를 1시간 배양 후, 포도당을 배지에 첨가하였다. 24시간 배양 후, 제조사의 지침에 따라 formazan crystal을 DMSO에 녹여 microplate reader를 사용하여 492 nm에서 흡광도를 비교하였다.
5. 유세포 분석에 의한 세포주기 분석
MC3T3-E1 세포에서 고당 처리에 의해 유도된 세포사멸을 EECF가 억제할 수 있는지를 조사하기 위하여 propidium iodide(PI) 염색에 의한 세포주기 변화에 미치는 영향을 분석하였다. 이를 위하여 EECF가 있거나 없는 배지에서 24시간 동안 고당에 노출된 세포를 trypsin 처리를 통해 단일 세포 현탁액을 제조하고 phosphate-buffered saline(PBS)으로 수세 후 70% 에탄올 용액으로 세포를 15분간 고정시켰다. 고정된 세포를 15분간 상온에서 PI (Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액으로 염색하고 다시 PBS로 수세 후, 유세포 분석기(flow cytometer, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 histogram의 sub-G1기에 해당하는 빈도로 세포사멸이 유발된 세포의 빈도를 산출하였다.
6. 콜로니 형성(colony formation) 분석
고당 처리에 의한 MC3T3-E1 세포의 단일 세포의 증식 억제에 미치는 EECF의 영향을 평가하기 위하여, EECF가 있거나 없는 조건에서 고당이 24시간 처리된 세포를 모았다. 이들 세포를 단일로 현탁 후 6-well plates(100 cells/well)에 접종시키고, 이틀 간격으로 배지를 교환하면서 2주간 배양하여 콜로니를 형성하였다. 형성된 콜로니를 4% formaldehyde(Thermo Fisher Scientific Inc.)로 고정시키고, 0.1%의 purple-violet(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액으로 상온에서 10분간 염색하였다. 염색 후 다시 PBS로 세척한 후, 콜로니의 이미지를 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 촬영하였다.
7. 단백질 발현의 분석
EECF가 있거나 없는 조건에서 고당이 처리된 세포의 특정 단백질 발현 분석을 위하여 처리가 끝난 세포들을 모아 PBS로 세척하고 총 단백질을 분리하기 위하여 radioimmunoprecipitation assay 용액(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 세포를 용해시켰다. Immunoblotting을 위하여 Bio-Rad Protein Assay Reagent(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 분리된 단백질을 정량화하고 같은 양의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 polyvinylidene difluoride membrane(Sigma-Aldrich Chemical Co.)으로 옮기고 5% non-fat dry milk로 상온에서 막을 blocking 시킨 후 조사 대상 단백질에 해당하는 항체를 사용하여 4 ℃에서 12시간 반응시켰다. 막을 다시 0.1%의 Tween® 20 Detergent (Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 수세 후 1차 항체에 적절한 2차 항체(Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)로 상온에서 2시간 이상 반응시켰다. 항체 반응이 끝난 막을 Enhanced Chemiluminescence Plus Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분석 대상 단백질의 시각화하고 Fusion FX Image System(Vilber Lourmat, Torcy, France)을 이용하여 단백질 밴드를 검출한 후 ImageJ(Ver. 1.46; NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 밴드를 정량화하고 β-actin으로 표준화하여 발현 비율을 제시하였다.
8. 세포 내 glutathione(GSH)/GSH disulfide(GSSG) 함량 및 manganese superoxide dismutase(MnSOD) 활성 측정
세포 내 GSH 및 GSSG 함량의 변화는 Glutathione GSH/GSSG Assay Kit(Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 측정하였다. 이를 위하여 EECF가 함유되어 있거나 없는 배지에서 1시간 배양한 후 고당을 24시간 동안 처리한 세포를 PBS로 세척 후, 제조사의 지침에 따라, GSH 및 GSSG 함량을 microplate reader로 측정하였다. GSH와 GSSG 농도의 차이는 표준 곡선을 바탕으로 GSSG 농도(ratio=total glutathione-2GSSG/GSSG)로 나누어 GSH/GSSG 비율을 제시하였다. 또한, 동일 조건에서 배양된 세포를 대상으로 MnSOD 활성의 분석은 Abcam, Inc.에서 구입한 Colorimetric kit를 이용하였다. 이를 위하여 제조사의 지침에 준하여 세포 분획물을 제조하고 각 효소의 활성은 대조군에 대한 상대적인 값으로 제시하였다.
9. ROS 생성 분석
고당 처리된 MC3T3-E1 세포에서 EECF의 ROS 생성 억제 효능을 평가하기 위하여 세포 내 총 ROS 검출에 널리 사용되는 세포 투과성 형광성 프로브(cell-permeable fluorogenic probe)인 2’,7’-di-chlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA)를 사용하였다. 이를 위하여 고당을 1시간 처리하기 전에 EECF를 1시간 전처리한 조건에서 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 제조사의 지침에 따라 암실에서 30분 동안 DCF-DA(10 μM, Molecular Probes, Leiden, Netherlands)로 염색을 하였다. 이어서 PBS로 세척 후 유세포 분석기를 이용하여 ROS의 생성 정도를 측정하였다.
10. 조골세포의 분화 유도
고당에 의한 조골세포 분화 억제에 미치는 EECF의 영향을 평가하기 위하여 MC3T3-E1 세포를 6-well plate에 세포(5×104 cells/mL)를 분주하고 세포가 90%의 confluence에 도달되면 배양 배지를 분화 유도 배지(osteogenic medium, OGM; 10 mmol/L의 β-glycerophosphate 및 50 μg/mL ascorbic acid가 부충된 α-MEM)로 교체하였다. 이후 이틀 간격으로 교체하면서 7일간 배양하거나(5.5 mM 포도당 포함된 배지에서 배양된 대조군), 20 mM의 포도당 처리된 배지(고당 처리군) 또는 EECF 및 20 mM의 포도당이 처리된 배지(고당 및 EECF 처리군)를 이틀간 교체하면서 7일간 배양하였다.
11. ALP 및 Alizarin Red S 염색
MC3T3-E1 세포가 조골세포로의 분화에 미치는 고당의 영향을 조사하기 위하여 ALP의 활성과 칼슘 침착의 정도를 평가하였다. 이를 위하여 고당 단독 또는 EECF가 함께 함유된 분화 유도 배지에서 세포를 배양하였다. 7일 후, ALP의 활성과 칼슘 침착의 정도를 평가하기 위하여 배양이 끝난 세포를 PBS로 세척 후 4% formaldehyde 용액을 이용하여 고정시켰다. 이어서 TRACP & ALP Double-stain Kit(Takara Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan)를 이용한 ALP 활성을 측정하기 위하여 제조업체의 지침에 따라 ALP 기질을 첨가하고 37 ℃에서 배양하였다. 그리고 칼슘 침착의 정도를 조사하기 위하여 2%의 Alizarin Red S 용액(Sigma-Aldrich Co.)으로 30분 동안 염색하였다. 모든 처리가 끝난 세포들은 다시 PBS로 수세 후, 염색된 세포 이미지를 위상차 현미경(phase-contrast microscopy, Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였다.
12. Runx2 발현 검출을 위한 형광 염색
조골세포 분화의 핵심 조절자인 Runx2의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양된 세포를 4% formaldehyde 용액으로 고정시켰다. 고정된 세포를 0.2% Triton X-100 (Thermo Fisher Scientific) 및 bovine serum albumin (Sigma-Aldrich Co.) 용액에 반응시킨 후, Runx2 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.) 및 해당 2차 항체(Alexa Fluor 488 goat-anti-rabbit, Signaling Technology Inc. Beverly, MA, USA)로 연속 반응시키고 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, Thermo Fisher Scientific) 용액으로 핵을 다시 염색시켰다. 염색이 끝난 세포를 PBS-T로 수세 후 형광현미경 하에서 Runx2 및 핵의 이미지를 관찰하였다.
Ⅲ. 결 과
1. MC3T3-E1 세포에서 고혈당에 의한 세포독성에 미치는 EECF의 영향
EECF 또는 포도당이 포함된 배지에서 배양된 세포를 대상으로 세포 생존율을 조사하였다. 이를 위하여 24시간 동안 다양한 농도의 EECF(0∼400 μg/ml)를 처리한 후, MTT 분석을 수행하였으며, Fig. 1A 및 B에 그 결과를 제시하였다. 제시된 결과에서 알 수 있듯이, 300 μg/ml 이하의 EECF가 처리된 세포에서 대조군에 비하여 세포 생존율의 유의적인 감소는 관찰되지 않았다. 그리고 다양한 농도의 포도당이 함유된 배지에서 배양된 MC3T3-E1 세포의 경우, 10 mM 이상의 포도당이 처리된 세포에서 대조군 대비 처리된 포도당의 농도가 증가할수록 세포 생존율의 저하를 유의적으로 억제되었다. 따라서 고당에 의한 세포독성 유발을 위한 포도당 처리 농도는 약 60% 정도의 생존율을 보인 20 mM로 설정하였으며, 이러한 고혈당 조건에 대한 보호 효과를 조사하기 위한 EECF의 농도는 세포 생존율에 영향을 미치지 않았던 300 μg/ml로 설정하였다. 이상에서 설정된 농도를 기준으로 MC3T3-E1 세포에서 고당에 대한 세포 생존율 억제에 대한 EECF의 보호 효과를 조사하기 위하여 300 μg/ml의 EECF를 세포에 1시간 동안 전처리 후, 20 mM의 포도당을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. Fig. 1C에 제시된 MTT 분석의 결과에 의하면, 고당에 의해 저하된 세포 생존율(59.4%)이 EECF가 존재하는 조건에서는 유의적으로 회복(79.2%)되었음을 알 수 있었다. 고당 환경에 노출된 MC3T3-E1 세포에서 EECF의 보호 효능을 추가로 확인하기 위하여 세포독성 평가 지표인 LDH의 방출 정도를 조사하였다. Fig. 1D에 제시된 결과에 따르면, 고당 단독 처리된 MC3T3-E1 세포에서 LDH의 방출은 대조군에 비하여 약 4.3배 증가한 반면, EECF 단독 처리군에서는 유의적인 변화가 없었다. 그러나 EECF가 존재하는 배지에 고당 처리된 배지 배양된 세포에서의 LDH 방출은 대조군 대비 약 2.7배로 나타났다. 이러한 결과는 EECF가 고당에 의해 유발된 세포독성을 현저히 차단하였음을 의미한다.
Fig. 1
Effects of ethanol extract of Corni Fructus (EECF) on high glucose-induced reduction of cell viability and release of LDH in MC3T3-E1 cells.
Cells were treated with different concentrations of EECF (A) or glucose for 24 h (B), or treated with 300 μg/ml EECF for 1 h, and then treated with 20 mM glucose for 24 h (C and D). (A-C) The results of cell viability according to MTT assay were shown. (D) The amounts of LDH leaked from cells into the cell culture medium were expressed as relative values. The results were expressed as the mean±SD(*p<0.05 vs control group, #p<0.05 vs 20 mM glucose-treated group).
2. MC3T3-E1 세포에서 고당에 의한 세포사멸 유도에 미치는 EECF의 영향
MC3T3-E1 세포에서 고당에 의한 EECF의 세포독성 차단 효과가 세포사멸 유도의 억제와 연관성이 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 EECF가 있거나 없는 조건에서 고당을 처리한 세포들을 대상으로 PI 염색에 의한 세포주기 분석을 수행하였다. Fig. 2A 및 B에 나타낸 결과에서처럼, 세포사멸이 유도된 빈도에 해당되는 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도가 대조군(2.6%)에 비하여 고당 처리군(15.6%)에서 약 6배 증가하였지만, EECF를 전처리하였을 경우, 현저히 감소(5.4%)하였다. 각 세포주기에 분포된 세포들 사이의 빈도에는 유의적인 차이점이 관찰되지 않았다. MC3T3-E1 세포에서 고당에 의한 세포독성 유발은 세포 증식의 억제에 의한 세포사멸 유도로 이어지는 것을 확인하기 위하여 콜로니 형성 분석을 수행하였다. 이를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양된 세포를 모아 이를 2주간 배양하였으며, 형성된 콜로니의 수를 Fig. 2C 및 D에 제시하였다. 제시된 결과에서 알 수 있듯이, 고당 처리된 조건에서 배양된 MC3T3-E1 세포의 콜로니 형성이 크게 감소되었고, 그 크기도 대조군에 비하여 매우 적음을 알 수 있었지만, EECF가 존재하는 조건에서는 이를 유의적으로 억제하였다. 아울러 세포 증식의 지표인 proliferating cell nuclear antigen(PCNA) 단백질 발현31을 immunoblotting을 통하여 분석하였으며, 대조군에 비하여 고혈당 단독 처리군에서는 PCNA의 발현이 현저히 감소되었지만, EECF의 전처리군에서는 상당히 회복되었음을 알 수 있었다(Fig. 2E, F).
Fig. 2
Effects of ethanol extract of Corni Fructus (EECF) on high glucose-induced induction of apoptosis, reduction of colony formation and inhibition of PCNA expression in MC3T3-E1 cells.
(A, B, E and F) cells were cultured for 1 h in medium containing with or without 300 μg/ml EECF and then exposed to high glucose (20 mM glucose) for 24 h. (A and B) After treatment, flow cytometry was performed on PI-stained cells (A), and the frequency of cells in sub-G1 phase was presented (B). (C and D) Cells treated with high glucose for 24 h in the presence or absence of EECF were inoculated into 6-well plates and cultured for 2 weeks with medium exchanged every 2 days to form colonies. The formed colonies were stained with a violet-violet solution, and images of the colonies were taken with an inverted microscope (C), or the numbers of colonies formed were expressed as an average value (D). (E and F) Proteins were extracted from cells, and PCNA expression was detected through immunoblotting (E), and protein expression changes were normalized to β-actin as an internal control (F). (B, D and E) The results were expressed as the mean±SD (*p<0.05 vs control group, #p<0.05 vs high glucose-treated group).
3. MC3T3-E1 세포에서 고당에 의한 ROS의 생성에 미치는 EECF의 영향
다음은 고당에 의한 세포독성의 유발이 산화적 스트레스에 의한 것인지, 그리고 EECF의 고당 유도 세포독성 억제 현상이 항산화 활성에 기인한 것인지를 조사하였다. 이를 위하여 세포 내에서 강력한 항산화제 역할을 하는 GSH 함량 변화를 먼저 조사하였으며, Fig. 3A에 제시된 결과에 의하면, 고당 조건에서 배양된 MC3T3-E1 세포에서 GSH/GSSG의 비율이 현저하게 감소되었지만 이를 EECF가 유의적으로 억제하였음을 알 수 있다. 그리고 고당에 의한 GSH 함량의 감소가 ROS 생성 증가를 유도하였는지, 또한 이를 EECF가 감소시킬 수 있는지를 조사하였다. DCF-DA 염색에 의한 유세포 분석의 결과에 의하면, 대조군(3.5%)에 비하여 고당 처리된 세포에서의 세포 내 ROS 생성 증가를 의미하는 DCF-양성 반응을 보인 세포의 빈도가 10배 이상 증가(36.45%)하였지만, EECF가 전처리된 세포에서는 현저하게 감소(10.2%) 되었다(Fig. 3B, C). 이어서, GSH와 함께 ROS 생성 억제에 핵심적인 역할을 하는 SOD 중에서 미토콘드리아 호흡의 주요 부산물인 자유 라디칼 슈퍼옥사이드를 해독하는 필수 미토콘드리아 항산화 효소인 MnSOD의 활성에 미치는 변화를 조사하였다. Fig. 3D의 결과에서 알 수 있듯이, 고당에 노출된 MC3T3-E1 세포에서 MnSOD의 활성은 대조군에 비하여 40% 이상 감소되었지만, EECF가 존재하는 조건에서는 80% 이상의 MnSOD 활성을 유지하고 있었다.
Fig. 3
Effects of ethanol extract of Corni Fructus (EECF) on high glucose-induced inhibition GSH/GSSG ratio, generation of ROS and suppression of MnSOD activity in MC3T3-E1 cells.
cells were cultured for 1 h in medium containing with or without 300 μg/ml EECF and then exposed to high glucose for 24 h (A and D) or 1 h (B and C). (A) After treatment, the contents of GSH and GSSG were measured and presented as relative values. (B and C) The level of intracellular ROS production was determined using flow cytometry after staining with DCF-DA, and a representative profile (B) and the percentages of DCF-positive cells were presented (C). (D) The activity of MnSOD was measured for cells cultured under different conditions and presented as relative values. (A, C and D) The results were expressed as the mean±SD (*p<0.05 vs control group, #p<0.05 vs high glucose-treated group).
4. MC3T3-E1 세포에서 고당에 의한 조골세포 분화 억제에 미치는 EECF의 영향
따라서 MC3T3-E1 세포에서 관찰된 EECF의 항산화 활성이 고당에 의한 조골세포의 분화 억제를 회복시킬 수 있는지를 조사하였다. 이를 위하여, MC3T3-E1 세포를 정상 분화 유도 배지에서 배양하면서 분화를 유도하거나, 고당 단독 또는 EECF가 함께 처리된 분화 유도 배지에서 배양하였다. 7일 후, MC3T3-E1 세포의 조골세포로의 분화를 고당이 억제하였는지를 확인하기 위하여 ALP의 활성과 칼슘 침착의 정도를 조사하였다. 먼저, ALP의 활성을 조사한 Fig. 4A 및 B의 결과에 의하면, 고당이 존재하는 조건에서 ALP의 활성은 고당이 처리되지 않은 분화 유도 배지에서 배양된 MC3T3-E1 세포에 비하여 현저하게 억제되었음을 알 수 있다. 그리고, Alizarin Red S 염색에 의한 칼슘의 침착 또한 고당 처리된 조건에서 매우 저하되었다(Fig. 4C, D). 그러나 EECF가 함유된 배지에서는 고당 처리에 의해 억제된 ALP의 활성과 칼슘 침착이 유의적으로 회복되었다.
Fig. 4
Effect of ethanol extract of Corni Fructus (EECF) on ALP activity and calcification in high glucose-treated MC3T3-E1 cells.
after culturing the cells in OGM containing EECF and/or high glucose for 7 days, the expression and activity of ALP (A and B) were investigated, and the degree of calcification was evaluated using Alizarin Red S staining (C and D). (A and C) Representative images were captured using an inverted microscope. (B) ALP activity analyzed using cell lysate isolated from cells was presented as a relative value. (D) Calcium deposition was quantified based on Alizarin Red S staining and results were calculated as fold induction of control cells. (B and D) The results were expressed as the mean±SD (*p<0.05 vs control group, #p<0.05 vs high glucose-treated group).
5. MC3T3-E1 세포에서 고당에 의한 Runx2의 발현 억제에 미치는 EECF의 영향
이상에서 관찰된 고당에 의한 조골세포 분화 억제에 대한 EECF의 차단 효과가 조골세포 분화에 필수적인 전사 인자인 Runx2의 발현12,13 변화와 관련성이 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 상기에 같은 조건에서 배양된 MC3T3-E1 세포의 단백질을 추출하여 Runx2의 발현을 immunoblotting으로 분석하였으며, 정상적으로 분화가 유도된 세포에 비하여 고당이 처리된 세포에서 Runx2의 발현이 현저하게 억제되었으나 EECF가 있는 조건에서는 대조군 수준으로 유지되었다(Fig. 5A, B). 아울러 Runx2 항체 및 DAPI 염색에 의한 결과에 의하면, 분화 유도 배지에서 배양된 MC3T3-E1 세포에서 Runx2가 핵에서 강하게 발현되고 있었으며, 세포질에서는 거의 발현이 되지 않았음을 면역 형광 반응을 통하여 확인할 수 있었으며, 고당 단독 및 EECF와 공동 처리된 세포에서 그 발현 변화의 양상은 immunoblotting의 결과와 유사하게 나타났다(Fig. 5C). 따라서 이러한 결과는 고당에 의한 조골세포 분화의 억제에는 최소한 Runx2의 전사 활성 억제가 관여할 것이며, 이를 EECF가 유지시켜 줌으로써 분화 억제를 차단하였을 것으로 추정된다.
Fig. 5
Effect of ethanol extract of Corni Fructus (EECF) on expression of Runx2 reduced by high glucose treatment in MC3T3-E1 cells.
after culturing the cells in OGM containing EECF and/or high glucose for 7 days, Runx2 expression was detected by immunoblotting (A) and relative expression was normalized to β-actin as an internal control (B). The results were expressed as the mean±SD (*p<0.05 vs control group; #p<0.05 vs high glucose-treated group). (C) After staining the cells using RUNX2 antibody, images of Runx2 expression (Red) were obtained with a fluorescent microscope. DAPI staining (blue) was performed for visualization of nuclei.
6. MC3T3-E1 세포에서 고당에 의한 조골세포 분화 인자의 변화에 미치는 EECF의 영향
Osx는 Runx2와 함께 조골세포 분화 및 뼈 무기질화에 필수적인 또 다른 전사 인자이며13, Runx2와 함께 ALP, OPN 및 OCN 등과 같은 세포외 기질의 무기질화와 골 형성 관련 유전자의 전사 활성을 조절한다32. 따라서 고당에 의한 MC3T3-E1 세포의 조골세포 분화 억제에 이들 유전자 발현 변화가 동반되었는지, 또한 EECF가 이들의 변화를 차단하였는지를 조사하였다. Fig. 5에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이, Osx의 단백질 발현은 Runx2 처럼 고당 조건에서 현저히 감소하였지만, EECF에 의하여 유의적으로 회복되었다. 그리고, ALP의 발현 또한 고당 처리에 의하여 억제되어 Fig. 4A 및 B의 결과와 잘 일치되었고, OPN과 OCN의 발현도 고당이 처리된 MC3T3-E1 세포에서 감소되었지만, 이들은 모두 EECF가 있는 조건에서는 유의적인 회복을 보였다(Fig. 6). 따라서 고당에 의한 ALP, OPN 및 OCN의 발현 감소는 Runx2와 Osx의 전사 활성 저해에 의한 것임을 알 수 있었으며, EECF에 의한 Runx2와 Osx의 발현의 보존은 MC3T3-E1 세포의 조골세포 분화능의 유지에 기여하였음을 알 수 있다.
Fig. 6
Effects of ethanol extract of Corni Fructus (EECF) on the expression of osteogenic differentiation-related proteins in high glucose -treated MC3T3-E1 cells.
after culturing the cells in OGM containing EECF and/or high glucose for 7 days, the levels of OSX, ALP, OPN and OCN proteins were detected by immunoblotting using antibodies corresponding to each protein (A) and their relative expression was normalized to β-actin as an internal control (B). The results were expressed as the mean±SD (*p<0.05 vs control group, #p<0.05 vs high glucose-treated group).
7. MC3T3-E1 세포에서 고당에 의한 PI3K/Akt 신호계의 억제에 미치는 EECF의 영향
조골세포의 분화는 다양한 세포 내 신호계에 의하여 조절되며, 특히 PI3K/Akt 신호계는 Runx2와 Osx의 전사 활성 및 골 형성 과정의 촉진에 전반적으로 광범위하게 관여한다16,33. 따라서 고당에 의한 Runx2와 Osx 발현의 감소와 동반된 MC3T3-E1 세포의 분화 억제에 미치는 PI3K/Akt 신호계의 연관성과 EECF의 영향을 조사하였다. Immunoblotting 결과에 의하면, 정상 분화 유도 배지에서 분화가 유도된 세포에서 뿐만 아니라, 고당 처리에 의하여 분화가 억제된 세포와 EECF의 공동 처리에 의하여 분화가 유지된 세포 모두에서 PI3K와 Akt의 총 단백질 함량의 변화는 관찰되지 않았지만, 고당이 단독 처리된 세포에서는 그들의 활성형인 인산화된 PI3K 및 Akt(phosphorylated(p)-PI3K 및 p-Akt)의 발현은 현저히 억제되었다(Fig. 7). 그러나 고당에 의한 이러한 PI3K/Akt 신호계의 불활성화는 EECF의 처리에 의해 크게 개선되었으며, 이는 EECF에 의한 PI3K/Akt 신호계의 활성 유지가 고당에 의한 MC3T3-E1 세포의 조골세포 분화 억제의 차단에 최소한 관여하고 있음을 의미한다.
Fig. 7
Effect of ethanol extract of Corni Fructus (EECF) on high glucose -induced inactivation of PI3K/Akt signaling pathway in MC3T3-E1 cells.
after culturing the cells in OGM containing EECF and/or high glucose for 7 days, the levels of total protein and phosphorylated forms of PI3K and Akt were detected by immunoblotting using antibodies corresponding to each protein (A) and their relative expression was normalized to β-actin as an internal control (B). The results were expressed as the mean±SD (*p<0.05 vs control group, #p<0.05 vs high glucose-treated group).
Ⅳ. 고 찰
MC3T3-E1 세포를 이용한 고당 처리는 in vitro 수준에서 조골세포의 생물학적 기능을 이해할 수 있는 모델로 널리 사용되고 있으며34,35, 본 연구에서는 당뇨병 환자의 생체 내 포도당 혈청 수준이 약 540mg/dL인 고당 환경36을 모방하기 위해 이보다 약간 낮은 수준이면서 MC3T3-E1 세포에 세포독성을 유발하는 20 mM로 설정하였다. 이러한 고당에 의한 세포독성에 미치는 EECF의 영향을 조사하기 위하여 미토콘드리아 내의 석신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)의 활성에 근거하여 세포 생존율을 평가하는 MTT 분석과 세포의 막이 손상되었을 경우 세포 배양액으로 빠르게 방출되는 LDH의 양을 분석하였다37. 본 연구에서 고당에 노출된 MC3T3-E1 세포에서는 세포사멸 지표인 sub-G1기에 속하는 빈도가 대조군에 비하여 유의적으로 증가되어 세포사멸이 유도되었음을 알 수 있었다. 그리고 증식 지표인 코로니 형성의 빈도와 PCNA의 발현31도 고당 처리된 MC3T3-E1 세포에서 저하되었지만 이러한 현상은 EECF가 존재하는 조건에서는 모두 회복되었다. 이러한 결과는 EECF가 MC3T3-E1 세포에서 고당에 의한 세포독성을 차단할 수 있음을 보여주는 것이다.
GSH는 글루탐산, 시스테인 및 글리신으로 구성된 tripeptide로서 GSH peroxidase, GSH S-transferase, thioltransferase 등과 같은 효소의 기질로 사용되며 ROS에 의한 손상으로부터 세포를 보호하는 항산화에 관여한다. GSH는 일반적으로 환원된 형태(GSH)로 존재하며 산화적 스트레스와 같은 자극에 의해 산화된 형태(GSSG)로 전환되기 때문에 GSH와 GSSG의 비율은 산화적 스트레스의 지표로 널리 사용된다38,39. 본 연구의 결과에 의하면 고당 처리된 MC3T3-E1 세포에서 GSH/GSSG의 비율이 현저하게 억제되었으며, 이는 선행 연구의 결과들과 잘 일치되게 ROS 생성의 증가와 연관성이 있었다35,40,41. 아울러 슈퍼옥사이드를 산소와 과산화수소로 전환하는 항산화 효소인 SOD 중에서 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 해독에 관여하는 MnSOD의 활성42,43,이 고당 처리된 MC3T3-E1 세포에서 현저히 감소하였다. 이는 고당 환경에 노출된 MC3T3-E1 세포는 심각한 산화적 스트레스 상태에 처한 상태이며, 미토콘드리아의 손상이 동반되었음을 의미한다. 그러나 EECF는 고당에 의하여 이러한 산화적 스트레스 지표들을 모두 개선하였으며, EECF의 항산화 활성은 고당에 의해 유도된 세포독성의 차단에 기여하였음을 알 수 있었다. 조골세포의 미토콘드리아 기능 장애는 고혈당에 의한 당뇨병성 골다공증의 직접적인 원인으로 작용할 수 있으며, 최근 연구에 따르면 미토콘드리아 생물 발생은 당뇨병과 같은 여러 질병 상태에서 세포 복구와 생존을 향상시키는 것으로 나타났다44,45. 따라서 EECF의 항산화 활성과 연관된 조골세포의 항상성 유지에 미토콘드리아의 기능 보존 관련 기전 연구는 추가적인 연구가 이루어져야 할 것이다. 이상에서 관찰된 EECF의 고당에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 차단 효과가 조골세포 분화의 억제 또한 차단할 수 있는지를 이어서 조사하였다. 이를 위하여 조골세포 분화 유도 배지를 이용하여 MC3T3-E1 세포의 분화를 시도하면서 고당이 첨가되었을 경우, 분화 형성이 억제되는지와 이에 미치는 EECF의 영향을 조사하였다. 조골세포의 활성을 평가할 수 있는 다양한 생화학적 지표 중에서, ALP는 뼈 형성 및 뼈 석회화의 초기 뼈 형성 지표로 잘 알려진 막 결합 당단백질(membrane-bound glycoprotein)이며, Alizarin Red S 염색은 조골세포 칼슘 침착에 따른 광물화의 정량화를 위해 널리 사용된다46,47. 본 연구의 결과에 의하면 분화 유도 배지에서 배양된 세포에 비하여 고당이 첨가된 배지에서 배양된 MC3T3-E1 세포에서의 ALP의 활성과 칼슘 침착 현상이 현저하게 감소하였으며, EECF가 존재할 경우, 이들의 감소는 유의적으로 억제되었다. 이는 EECF는 고당에 의한 당뇨병성 골다공증을 완화시킬 수 있을 가능성이 있음을 보여주는 결과이다.
선행 연구에 의하면, 고당 처리에 의한 MC3T3-E1 세포의 조골세포 분화를 억제는 Runx2 및 Osx 등과 같은 조골세포 분화 유도에 관여하는 전사 인자들의 발현 감소가 관여하였으며, 이는 ROS 의존적인 현상이었다40,48. 그리고 OPN 및 OCN과 같은 뼈 기질 단백질은 뼈 형성 및 조직 무기화 과정에서 ALP와 함께 성숙한 조골세포에 의해 생성되지만12,14, 고당은 이들 모두의 발현이 감소시켜 조골세포의 분화 및 기능을 억제함으로써 당뇨병성 골다공증 유도에 기여함이 보고된 바 있다49. 본 연구에서도 선행 연구들의 결과와 잘 일치되게, 정상적으로 분화가 유도된 MC3T3-E1 세포에 비하여 고당 처리된 MC3T3-E1 세포에서는 이들 단백질의 발현은 모두 억제되었지만, EECF는 이를 유의적으로 차단하여 EECF가 고당 조건에서 조골세포의 분화 능력을 유지하여 당뇨병성 골다공증에 대한 보호 효과를 나타낼 수 있음을 의미하는 것이다. 조골세포의 분화 과정은 세포 내 특정 신호전달 경로와 밀접하게 연관되어 있으며, 그중 PI3K/Akt 경로는 조골세포의 생물학적 특징과 뼈 형성에 중요한 기능을 수행한다16,33. 산수유 추출물 또는 구성 성분들은 다양한 실험 모델에서 PI3K/Akt 신호계의 활성을 조절할 수 있음이 보고된 바 있다. 예를 들어, 산수유 유래 생리활성 물질들은 근 위축(muscle atrophy), Alzheimer 병 및 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 유발 관련 인자들의 활성을 PI3K/Akt 신호계의 활성을 통하여 억제하였다50-52. 또한, 제2형 당뇨병 실험 모델에서 산수유에서 분리된 사포닌에 의한 포도당과 지질 대사의 개선과 염증 및 산화적 스트레스와 췌장 및 간 손상을 완화에는 PI3K/Akt 신호계의 활성이 관여하였다53. 본 연구의 결과에 의하면, 고당 단독 처리된 MC3T3-E1 세포에는 PI3K/Akt 경로의 불활성화를 의미하는 두 단백질의 인산화가 매우 억제되었지만, EECF가 존재하는 조건에서는 이러한 현상이 유의적으로 차단되어 고당 환경에서 EECF에 의한 조골세포 분화 유도의 진행에 PI3K/Akt 경로의 활성화가 최소한 요구됨을 알 수 있었다. 한편, transforming growth factor-β(TGF-β)/bone morphogenic protein(BMP) 신호계는 Smad로 알려진 전사 인자의 활성을 통하여 뼈 형성에 핵심적인 역할을 하는 것으로 널리 알려져 있으며, 이 과정에는 PI3K/Akt 신호계의 활성화가 관여한다54,55. Smad는 핵에서 Runx2와 Osx의 전사 활성을 증가시키며, BMP-2 유도에 의한 조골세포 분화가 진행된다56,57. 비록 본 연구의 결과에서 EECF가 고당에 의한 조골세포 분화에 핵심적인 PI3K/Akt 신호계의 활성을 증대시킬 수 있음은 제시하였지만, TGF-β/Smad/BMP 신호계를 포함한 PI3K/Akt 신호계의 조절에 관여하는 상위 및 하위 신호계 역할의 탐색에 관한 연구가 추가적으로 수행되어야 할 것이다. 한의학에서 산수유는 성질은 약간 따뜻하고(微溫) 맛은 시고(酸) 떫으며(澁) 독이 없고 음(陰)을 강하게 하고 정(精)을 보하며, 신기(腎氣)를 보하고 발기를 도우며 음경을 단단하면서 커지게 하고 정수(精髓)를 채우며, 허리와 무릎을 따뜻하게 한다고 한다22. 산수유 추출물과 구성 성분들이 항산화 활성을 가지면서 골다공증 예방과 뼈의 항상성 유지에 유익한 효능이 있는 것으로 알려졌으며, 당뇨병의 합병증 치료에 도움을 줄 수 있는 것으로 보고된 바 있으나 당뇨병성 골다공증에 대한 평가는 구체적으로 수행된 바 없다. 본 연구에서는 EECF가 고당 환경에서 유도되는 조골세포의 손상과 분화 억제를 차단하였음을 제시하였지만, 본 실험에 사용된 in vitro 모델은 기본적으로 제2형 당뇨병의 환경을 모방한 것이다. 그리고 본 연구에서 사용한 생쥐의 두개골에서 유래된 MC3T3-E1 세포는 뼈 관련 실험, 특히 골 분화와 형성 연구에서 매우 흔히 사용되는 세포이며, 당뇨병, 특히 고혈당 상태는 조골세포 분화가 억제되기 때문에 특정 후보물질의 효능 평가에서도 널리 사용되는 세포이다58. 그러나 이 세포를 가지고 수행하는 경우, 인간 세포와는 신호 전달 경로, 유전자 발현, 약물 대사 등에서 차이가 있을 수 있으며, 전신 대사 이상을 반영하기는 한계점이 있다. 따라서, 향후 연구에서는 제2형 당뇨병 질환 in vivo 모델을 통해 당뇨병성 골다공증의 뼈 손실 기전과 EECF의 산화적 스트레스의 억제 효능이 직접 연계되었음을 확인해야 할 것이다.
Ⅴ. 결 론
본 연구에서는 고혈당증을 모방한 조골세포 모델을 사용하여 산수유 에탄올 추출물(EECF)이 당뇨병성 골다공증을 예방할 수 있는지를 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면, MC3T3-E1 세포에서 EECF는 고당에 의한 세포독성을 유의적으로 차단하여 세포사멸 유도와 콜로니 형성 억제를 감소시켰다. 또한 고당은 MC3T3-E1 세포에서 GSH의 함량을 감소시켰으며 ROS의 생성을 매우 증가시켰다. 미토콘드리아 슈퍼옥사이드의 해독에 필수적인 효소인 MnSOD의 활성 또한 고당 처리된 MC3T3-E1 세포에서 현저히 억제되었으며, 이는 고당에 의해 생성된 ROS가 세포의 미토콘드리아 기능의 손상 유도에 의한 것임을 의미한다. 그러나 EECF가 존재하는 조건에서는 이러한 변화들이 모두 유의적으로 억제되었다. 고당은 MC3T3-E1 세포의 조골세포로의 분화를 억제하였음을 ALP의 활성 및 칼슘 침착의 감소로 확인하였으며, 이는 조골세포 분화에 관여하는 주요 인자인 Runx2, Osx, OPN 및 OCN 등의 발현 억제와 연관성이 있었다. 이러한 고당에 의한 조골세포의 분화 억제는 EECF에 의하여 유의적으로 차단되었으며, 이는 EECF에 의한 PI3K/Akt 신호 경로의 활성 유지와 밀접한 연관성이 있었다. 본 연구의 결과는 EECF가 고당에 의한 산화적 스트레스를 차단하면서 조골세포의 기능과 정상적인 분화 유도에 따른 뼈 항상성 유지를 위한 기능성 소재로서의 적용 가능성이 우수함을 시사한다. 그러나 EECF에 함유된 생리활성 물질에 대한 탐색과 그들의 조골세포 분화 과정에서의 효능은 동물 실험을 통한 추가 연구에서 밝혀져야 할 것이다.
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