Ⅰ. 서 론
염증(inflammation)은 조직의 손상이나 병원균의 침입 및 외부 자극으로부터 우리 몸을 보호하기 위한 필수적인 생체 내 면역반응이다1. 염증의 다양한 원인 중에서, lipopolysaccharide(LPS)는 내독소 역할을 하며 인체 내에서 강한 면역 반응을 이끌어낸다. 또한, LPS는 대식세포에서 가장 강력한 염증 활성화제로 작용하며, 다양한 전염증성 매개체들을 발현시킨다2. 정상적인 염증 반응은 항상성 유지와 조직 복구에 기여하지만, 과도한 면역 활성은 다양한 병리적 상태를 초래하여 염증성 질환을 유발할 수 있다3. 따라서 활성화된 염증 반응을 조절하고 염증 매개체의 생성을 억제하는 것은 제반 염증성 질환의 예방과 치료에 있어 매우 중요하다.
산화 스트레스는 주로 생체 내에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의해 유도되어 과도한 산화 반응을 일으키고, ROS의 과도한 축적은 피부의 화학적 및 형태학적 변화를 초래하여 염증 반응을 촉진시킨다. 이처럼 산화 스트레스와 염증 반응은 상호 연관되어 다양한 조직 손상 및 질병을 유발하며, 산화 스트레스를 감소시키는 항산화 작용은 염증 반응을 조절하는데 도움을 주므로 항산화 물질의 개발 또한 염증성 질환을 치료하는데 있어 중요한 과제이다4.
통증, 발열 및 염증에 대한 치료제로 흔히 사용되는 합성 비스테로이드 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)는 다양한 염증성 질환에 활용되며 그 효과가 뛰어나나, 위장관 출혈, 신기능 저하, 심부전 등의 위장관계, 신장, 심혈관계 부작용 및 합병증이 발생한다고 알려져 있다5. 따라서 부작용이 적고 안정성이 확보된 천연물 유래 항염증제 개발을 위한 연구가 지속되고 있으며, 특히 유6는 총 198편의 실험 논문을 분석하여 항염증 효과가 보고된 단일 약재, 복합 제제 및 한약 처방을 정리하였는데, 단일 약재로는 人蔘, 豆豉, 竹葉, 金銀花, 梔子, 知母, 山茱萸, 五味子 등 주로 淸熱藥, 補益藥, 收澁藥 계열의 약재가 사용되었고, 복합 제제에서는 黃蓮과 甘草의 활용 빈도가 높았으며, 한약 처방으로는 加味逍遙散, 當歸鬚散, 烏梅丸 등이 사용된 것으로 나타났다.
三仁湯은 ≪東醫寶鑑･雜病篇≫7에 수록된 처방으로, 薏苡仁, 冬瓜子, 桃仁, 牧丹皮로 구성되어 있으며 腸癰을 치료한다. 腸癰은 癰의 하위분류 중 內癰에 속하며, 氣血이 통하지 않아 皮肉에 발생하는 급성 화농성질환의 하나로서, 그 특징은 국부의 발적, 발열, 동통, 종창이다. 이는 현대의학의 염증의 개념과 일치되는 증상으로 三仁湯이 염증성 질환에 효과가 있을 것으로 사료되었으나8, 三仁湯을 구성하는 薏苡仁, 冬瓜子, 桃仁, 牧丹皮 각각의 개별 약재에 대한 항산화 효능 및 항염증 효과에 대해서는 다양한 연구9-16가 보고되어 있는 반면, 三仁湯 자체의 항산화 활성 및 염증 반응 개선 효과에 대한 연구는 아직까지 보고되지 않았다.
이에 三仁湯의 항산화 효능 및 항염증 기전을 규명하고자 본 연구를 시행하였다. 항산화 효능을 평가하기 위해 총 polyphenol 및 flavonoid 함량을 측정하였고, DPPH, ABTS radical 소거능을 확인하였다. 또한, 항염증 효과를 평가하기 위해 RAW 264.7 대식세포를 이용하여 NO, PGE2, Cytokine의 생성량과 염증 억제 기전 관련 인자들의 유전자, 단백질 발현량 및 인산화를 측정하였으며 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 재 료
2) 시 약
본 실험에는 gallic acid(Sigma, U.S.A.), quercetin (Sigma, U.S.A.), sodium carbonate(Sigma, U.S.A.), aluminium nitrate nonahydrate(Sigma, U.S.A.), potassium acetate solution(Sigma, U.S.A.), 1,1 -diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH)(Sigma, U.S.A.), 2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)(Sigma, U.S.A.), penicillin-streptomycin (Sigma, U.S.A.), trypan blue(Sigma, U.S.A.), lipopolysaccharides(Sigma, U.S.A.), protease inhibitor cocktail(Sigma, U.S.A.), phosphatase inhibitor cocktail (Sigma, U.S.A.), folin-ciocalteu’s phenol reagent(Merck, Germany), ethanol(Merck, Germany), methanol(Merck, Germany), EZ-cytox(DoGenBio, Korea), Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)(Gibco, U.S.A.), fetal bovine serum(FBS)(Gibco, U.S.A.), nitric Oxide plus detection kit(iNtRON Biotechnology, Korea), total RNA extraction kit, acrylamide-Bis Solution 30%(iNtRON Biotechnology, Korea), 1.5 M Tris-HCl(pH 8.8)(iNtRON Biotechnology, Korea), 0.5M Tris-HCl(pH 6.8)(iNtRON Biotechnology, Korea), 10X Tris-Glycine-SDS buffer(iNtRON Biotechnology, Korea), 10X transfer Buffer(iNtRON Biotechnology, Korea), 10X TBS with Tween 20(iNtRON Biotechnology, Korea), prostaglandin E2 Parameter Assay Kit(R&D Systems, U.S.A), mouse IL-1 beta ELISA kit(Komabiotech, Korea), mouse IL-6 ELISA kit(Komabiotech, Korea), mouse TNF-alpha ELISA kit(Komabiotech, Korea), RIPA lysis and extraction buffer(Thermo Fisher Scientific, U.S.A) Pierce™ BCA protein assay Kit(Thermo Fisher Scientific, U.S.A), 10% ammonium persulfate (Thermo Fisher Scientific, U.S.A) 등을 사용하였다.
3) 기 기
본 실험에는 extraction mantle(Misung Scientific, Korea), rotary vacuum evaporator(EYELA, Japan), freeze dryer(ilShinbiobase, Korea), CO2 incubator (Sanyo, Japan), autoclave(Sanyo, Japan), deep-freezer (Sanyo, Japan), clean bench(Vision scientific, Korea), vortex mixer(Vision scientific, Korea), centrifuge (Vision scientific, Korea), ice-maker(Vision scientific, Korea), plate shaker(Lab-Line, U.S.A.), micro plate reader(Molecular Devices, U.S.A.), nanodrop(Thermo Fisher Scientific, U.S.A.), PCR cycler(PCRmax, U.K.), real-time PCR cycler(Bioneer, Korea), chemidoc(Vilber Lourmat, France) 등의 장비를 사용하였다.
2. 방 법
1) 시료 추출
2첩 분량의 SIT(76 g)에 1 L의 증류수를 넣어 100 ℃에서 3시간 동안 추출하였으며, 여과지를 사용하여 추출물을 여과하였다. 여과된 추출물은 rotary vacuum evaporator를 통해 감압 농축하고 freeze dryer를 통해 동결건조를 진행하였다. 동결건조 완료 후, 11.49 g(수득률: 15.12%)의 분말을 얻어 -20 ℃에 보관하였으며, 실험 당일 소분하고 증류수에 용해하여 사용하였다.
2) 실험군 분류
RAW 264.7 세포에 LPS와 SIT를 처리하지 않은 군을 정상군(Normal), 500 ng/mL의 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도한 군을 대조군(Control)으로 설정하였다. 또한 SIT 투여군(50, 100, 200)은 500 ng/mL의 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도하고 각각 50, 100, 200 μg/mL 농도의 SIT를 투여한 군으로 분류하여 진행하였다.
3) 항산화 효능 평가
(1) 총 polyphenol 함량 측정
SIT를 1 mg/mL 농도로 준비하였으며, 시료 1 mL에 50% folin-ciocalteu’s phenol reagent 0.5 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시켰다. 반응용액에 Na2CO3 포화용액 1 mL와 7.5 mL 증류수를 차례로 혼합하여 30분간 정치시킨 뒤, 14,000 g에서 10분간 원심 분리분리한 후 상등액을 취해 760 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 polyphenol 함량은 gallic acid를 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였다.
(2) 총 flavonoid 함량 측정
SIT를 1 mg/mL 농도로 준비하였으며, 시료 0.1 mL과 80% 에탄올 0.9 mL을 혼합한 혼합물 0.5 mL에 10% aluminium nitrate와 1 M potassium acetate 0.1 mL 그리고 80% 에탄올 4.3 mL을 가하여 실온에 40분 방치한 뒤 415 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, quercetin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
(3) DPPH radical 소거능 측정
SIT의 최종 농도가 1, 10, 100, 1000 μg/mL의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150 μL와 시료를 100 μL씩 혼합하여 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 대조군은 증류수를 넣었으며, DPPH 용액의 대조군으로써는 에탄올을 넣어 보정값을 얻었다.
(4) ABTS radical 소거능 측정
SIT의 최종 농도가 1, 10, 100, 1000 μg/mL의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, ABTS 용액은 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 제조한 후, 암소에 하루 동안 방치하여 양이온(ABTS·+)을 형성시킨 다음 732 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1.5 이하가 나오도록 희석하고, 희석된 ABTS·+용액 150 μL와 시료를 5 μL씩 혼합하고, 실온에서 10분간 반응시킨 후, 732 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
4) 세포 배양
생쥐 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank; KCLB)에서 구입하여 사용하였으며, 10%의 FBS가 추가된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 세포의 계대 배양은 2-3일 주기로 진행하였다.
5) 세포 생존율 측정
RAW 264.7 세포를 48 well plate에 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 SIT를 50, 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후 배양액 100 μL당 10 μL의 EZ-Cytox 용액을 첨가하여 세포배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 micro plate reader기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
6) Nitric oxide(NO) 생성량 측정
RAW 264.7 세포는 48 well plate에 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 500 ng/mL의 LPS를 처리하고 SIT를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후 N1 buffer 100 μL를 추가하여 상온에서 10분간 반응시켰으며, 반응 후 N2 buffer 100 μL를 추가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응 후, micro plate reader기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
7) Prostaglandin E2(PGE2) 생성량 측정
RAW 264.7 세포는 48 well plate에 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 500 ng/mL의 LPS를 처리하고 SIT를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후 primary antibody 50 μL를 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 conjugate를 50 μL씩 추가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. plate에 있는 시약은 버리고 washing buffer를 넣어서 3회 세척하였다. 세척 후 substrate solution을 200 μL씩 추가하여 상온에서 30분 반응시켰다. 반응 후 stop solution을 100 μL씩 추가하여 micro plate reader기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, standard curve를 기준으로 절댓값으로 나타내었다.
8) Cytokine 생성량 측정
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 1×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 500 ng/mL의 LPS를 처리하고 SIT를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후, ELISA kit를 사용하여 96 well plate에 분리한 세포 배양액 100 μL를 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 plate에 있는 시약은 버리고 washing buffer를 넣어 4회 세척하였다. 세척 후 detection antibody를 100 μL씩 추가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 plate에 streptavidin-HRP 100 μL씩 추가하여 상온에서 30분 반응시켰다. 반응 후 TMB or pink-ONE solution 100 μL씩 각 well에 넣은 후 15분간 반응시키고 100 μL의 stop solution을 추가하여 micro plate reader기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, standard curve를 기준으로 절댓값으로 나타내었다.
9) 유전자 발현량 측정
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 1×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 500 ng/mL의 LPS를 처리하고 SIT를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후, 원심 분리하여 얻은 세포와 total RNA prep kit를 사용하여 RNA를 추출하였으며, 추출한 RNA는 reverse transcription premix와 혼합하고 PCR cycler를 사용하여 45 ℃에서 60분, 95 ℃에서 5분간 반응을 통해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 특정 유전자를 증폭시켜 확인하기 위해 real-time PCR을 진행하였으며, cDNA와 특정 유전자에 맞는 primer, SYBR green premix를 혼합하여 95 ℃에서 2분 동안 반응시키고 95 ℃에서 5초, 62.5 ℃에서 30초를 40회 반복하여 특정 유전자를 증폭시켰다. 유전자 발현량은 대조군의 유전자 발현량을 기준으로 상대 정량하였으며, 사용된 primer들의 정보는 다음과 같다(Table 2).
Table 2
Real-Time PCR Primer Sequences
10) 단백질 발현량 측정
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 1×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 500 ng/mL의 LPS를 처리하고 SIT를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후, 원심 분리하여 얻은 세포는 protease inhibitor cocktail Ⅰ, phosphatase inhibitor Ⅱ, Ⅲ가 포함된 RIPA buffer를 넣어 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 BCA protein assay kit를 이용하여 정량하였으며, sample loading buffer와 섞어 95 ℃에서 5분간 반응시켜 준비하였다. 준비된 단백질은 10% acrylamide gel을 통해 SDS-PAGE하여 크기별로 분리하였으며, PVDF membrane에 이동시켰다. 단백질이 옮겨진 membrane을 3% BSA에 담가 상온에서 2시간동안 반응시켰다. TBS-T buffer를 이용하여 세척하고 primary antibody를 넣어 4 ℃에서 16시간동안 반응시켰다. 다시 3회 세척하고 secondary antibody를 넣어 상온에서 1시간동안 반응시켰으며, 다시 세척하고 ECL solution을 통해 단백질을 발색시켰다. 이후, chemidoc fusion FX를 통해 단백질 발현량을 분석하였다.
Ⅲ. 결 과
1. 항산화 효능
Gallic acid를 표준물질로 하여 SIT에 존재하는 총 polyphenol 함량을 측정한 결과, 20.52±0.14 mg GAE/g 으로 나타났으며, Quercetin을 표준물질로 하여 SIT에 존재하는 총 flavonoid 함량을 측정한 결과, 5.93±0.51 mg QE/g 으로 나타났다(Table 3). 또한, DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, SIT에 대한 농도 의존적인 소거능의 증가가 나타났다(Fig. 1).
Table 3
Total Polyphenol and Total Flavonoid Contents of SIT
| Total polyphenol (mg GAE*)/g) | Total flavonoid (mg QE**)/g) |
|---|---|
| 20.52±0.14 | 5.93±0.51 |
Fig. 1
DPPH and ABTS radical scavenging activity of SIT.
SIT were incubated at 1, 10, 100, and 1000 μg/mL with DPPH solution for 30 min. The measurement of absorbance at 517 nm was completed to determine the activities. SIT were incubated at 1, 10, 100, and 1000 μg/mL with ABTS solution for 10 min. The measurement of absorbance at 732 nm was completed to determine the activities. The results were expressed as mean±standard deviation of mean from three independent experiments.
2. 세포 생존율
SIT는 50 μg/mL 이상의 농도에서 세포증식이 나타났으며, 400 μg/mL 이상의 농도에서는 90% 이하의 세포 생존율을 보여 본 실험에서는 200 μg/mL 농도까지 진행하였다(Table 4).
3. 항염증 효능
1) NO 생성량
NO 생성량을 측정한 결과, SIT 투여군은 100 μg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다(Fig. 2).
Fig. 2
Effect of SIT on NO, PGE2, IL-1β, IL-6, TNF-α level in RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were treated 50, 100, 200 μg/mL of SIT with 500 ng/mL LPS for 24 h. NO level were calculated as percentage relative to the control. Treated cells were measured by mouse PGE2, IL-1β, IL-6, TNF-α ELISA kit. The results of the three independent experiments were described as mean±standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD post-hoc test (p<0.05). Groups not sharing the same letter are significantly different, whereas groups with the same letter do not differ significantly. Normal : RAW 264.7 cells without treatment of LPS or SIT, Control : RAW 264.7 cells stimulated with LPS without SIT treatment, 50, 100, 200 : RAW 264.7 cells treated with LPS and SIT (50, 100, 200 μg/mL).
3) Cytokine 생성량
Cytokine 생성량을 측정한 결과, SIT 투여군의 IL-1β, IL-6 생성량은 100 μg/mL 이상의 농도에서, TNF-α 생성량은 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 2).
4) 유전자 발현량
유전자 발현량을 측정한 결과, SIT 투여군의 IL-6 발현량은 50 μg/mL 이상의 농도에서, iNOS, COX-2 발현량은 100 μg/mL 이상의 농도에서, IL-1β, TNF-α 발현량은 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 3).
Fig. 3
Effect of SIT on iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA expression level in RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were treated 50, 100, and 200 μg/mL of SIT with 500 ng/mL LPS for 24 h. iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA expression level were measured by polymerase chain reaction. The results of the three independent experiments were described as mean±standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD post-hoc test (p<0.05). Groups not sharing the same letter are significantly different, whereas groups with the same letter do not differ significantly. Normal : RAW 264.7 cells without treatment of LPS or SIT, Control : RAW 264.7 cells stimulated with LPS without SIT treatment, 50, 100, 200 : RAW 264.7 cells treated with LPS and SIT (50, 100, 200 μg/mL).
5) 단백질 발현량
단백질 발현량을 측정한 결과, SIT 투여군의 COX-2, IL-1β, IL-6 발현량은 50 μg/mL 이상의 농도에서, iNOS 발현량은 100 μg/mL 이상의 농도에서, TNF-α 발현량은 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 4).
Fig. 4
Effect of SIT on iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α protein expression level in RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were treated 50, 100, and 200 μg/mL of SIT with 500 ng/mL LPS for 24 h. The total cell extracts were subjected to 10% SDS-PAGE and western blot analysis with the respective primary and secondary antibodies. The result were presented by the mean±S.D from three independent experiments. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD post-hoc test (p<0.05). Groups not sharing the same letter are significantly different, whereas groups with the same letter do not differ significantly. Normal : RAW 264.7 cells without treatment of LPS or SIT, Control : RAW 264.7 cells stimulated with LPS without SIT treatment, 50, 100, 200 : RAW 264.7 cells treated with LPS and SIT (50, 100, 200 μg/mL).
6) 단백질 인산화
단백질 인산화를 측정한 결과, SIT 투여군의 ERK는 대조군에 비해 유의적인 변화가 나타나지 않았으며, JNK는 50 μg/mL 이상의 농도에서, p38은 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 5)
Fig. 5
Effect of SIT on ERK, JNK, p38 protein phosphorylation level in RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were treated 50, 100, and 200 μg/mL of SIT with 500 ng/mL LPS for 24 h. The total cell extracts were subjected to 10% SDS-PAGE and western blot analysis with the respective primary and secondary antibodies. The result were presented by the mean±S.D from three independent experiments. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD post-hoc test (p<0.05). Groups not sharing the same letter are significantly different, whereas groups with the same letter do not differ significantly. Normal : RAW 264.7 cells without treatment of LPS or SIT, Control : RAW 264.7 cells stimulated with LPS without SIT treatment, 50, 100, 200 : RAW 264.7 cells treated with LPS and SIT (50, 100, 200 μg/mL).
Ⅳ. 고 찰
한의학에서 癰은 氣血이 통하지 않아 皮肉에 발생하는 급성 화농성질환의 하나로서 臟腑에 발생하는 內癰과 體表에 발생하는 外癰으로 구분할 수 있으며, 그 특징은 국부의 발적, 발열, 동통, 종창으로, 이는 현대의학의 염증의 개념과 일치되는 증상이다. 특히, 內癰에 속하는 腸癰은 소장이나 대장에 癰膿이 발생하는 병증으로8, 임상에서는 주로 大腸癰을 많이 볼 수 있는데, 배꼽 오른쪽 부위가 아프며 오른쪽 대퇴를 구부려 모으고 오른쪽 다리로 서면 복통이 가중되는 것을 특징으로 한다. 또한, 오한, 발열, 두통, 오심, 구토, 변비 등의 증상을 수반하며, 서양의학적으로는 급성 충수염, 충수 농양, 복막염, 골반염, 골반 농양 등에 해당한다17. 腸癰을 치료하는 처방으로는 三仁湯7, 大黃牧丹皮湯8, 薏苡附子敗將散8 등이 알려져 있다.
三仁湯은 ≪東醫寶鑑･雜病篇≫7에 수록된 처방으로, 薏苡仁, 冬瓜子, 桃仁, 牧丹皮 총 4가지 약재로 구성되어 腸癰으로 뱃속이 갑자기 아픈 것을 치료한다. 薏苡仁은 性이 凉하고 味는 甘淡하여 健脾滲濕, 除痺止瀉, 淸熱排膿의 효능이 있으며18, 薏苡仁과 관련하여 허9는 DSS로 궤양성 대장염을 유발한 생쥐를 이용하여 薏苡仁 추출물이 COX-2의 발현 감소, 세포증식 및 세포보호를 통해 항염증 효과가 있음을 확인하였고, 이10는 collagen으로 관절염을 유발시킨 생쥐에 대하여 薏苡仁 약침이 염증성 cytokine 발현 및 증식을 억제하고 collagen fiber와 연골의 파괴를 감소시킴으로써 면역 세포 조절 및 염증 억제 작용을 나타냄을 실험적으로 확인하였다. 冬瓜子는 性이 凉하고 味는 甘하여 淸肺化痰, 消癰排膿, 利濕의 효능이 있으며19, 冬瓜子와 관련하여 김11은 冬瓜子가 염증 억제 인자인 A20의 발현을 유발하여 NF-κB의 활성을 억제함으로써 항염증 효과가 있음을 보고하였고, 박12은 冬瓜子 추출물이 DPPH radical 소거능과 총 polyphenol 함량을 증가시키고, NO 생성, TNF-α의 분비 및 멜라닌 합성을 저해시킴으로써 항산화, 항염증 및 미백 효능이 있음을 확인하였다. 桃仁은 性이 平하고 味는 苦甘하여 活血祛瘀, 潤腸通便의 효능이 있으며20, 桃仁과 관련하여 김13은 桃仁이 아토피 피부염 동물 모델에서 호산구 침윤 감소 및 혈청 IgE와 염증성 면역 세포 발현을 억제함으로써 항염증 효과가 있음을 확인하였고, 조14는 桃仁 껍질 추출물이 높은 전자 공여능과 SOD 유사활성 및 Xanthine oxidase 저해활성을 나타냄으로써 항산화 효과가 있으며, NO 생성과 iNOS 발현을 저해시킴으로써 항염증 효과가 있음을 보고하였다. 牧丹皮는 性이 微寒하고 味는 苦辛하여 淸熱凉血, 活血散瘀의 효능이 있으며21, 牧丹皮와 관련하여 박15은 牧丹皮의 Methyl Gallate 성분이 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포에 대해 염증 매개 물질을 억제함으로써 항염증 효과가 있음을 보고하였고, 김16은 牧丹皮로부터 분리한 Gallic Acid가 HaCaT 세포에서 TNF-α에 의해 유도되는 MMP-1의 발현을 저해시킴으로써 항산화 효과가 있음을 확인하였다.
三仁湯 외에 腸癰을 치료하는 대표 처방으로 알려진 大黃牧丹皮湯은 ≪金匱要略≫에 수록된 처방으로, 大黃, 芒硝, 牧丹皮, 桃仁, 冬瓜子로 구성되어 있으며8, 현재까지 大黃牧丹皮湯과 관련하여 항균22, 항산화5, 항염증23 효과를 밝힌 연구와 加減大黃牧丹皮湯의 급성 췌장염 억제 효과를 확인한 실험적 연구24가 보고되었다. 三仁湯과 大黃牧丹皮湯의 처방 구성을 비교해보면, 三仁湯은 大黃牧丹皮湯에서 大黃, 芒硝를 빼고 薏苡仁을 추가한 처방이라고 볼 수 있다. 薏苡仁은 祛濕을 위주로 하여 脾虛濕勝으로 인한 증상 및 濕溫初期에 상용하는 반면25, 大黃, 芒硝는 破瘀를 위주로 하여 實熱積滯로 인한 증상을 치료한다는 차이점이 있으나22, 薏苡仁의 淸熱排膿 효능을 통한 염증 억제 효과9는 大黃, 芒硝의 淸熱瀉下 효능을 통한 소염작용26과 비슷한 효과를 가질 것으로 보인다. 이는 실험적 연구를 통해 항산화, 항염증 효과가 밝혀졌으며 췌장염 등 염증성 질환의 치료제로서 긍정적인 효과를 나타낸 大黃牧丹皮湯과 같이 三仁湯 또한 다양한 염증성 질환의 예방 및 치료제로서 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
현재까지 三仁湯을 구성하는 薏苡仁, 冬瓜子, 桃仁, 牧丹皮의 개별 약재에 대한 항산화 및 항염증 연구9-16는 보고된 바가 있으나, 三仁湯 자체의 항산화 및 항염증 기전에 관한 연구는 아직까지 미비한 실정이다. 이에 본 연구에서는 in vitro 실험 방식으로 三仁湯의 항산화 및 항염증 효과 실험 연구를 설계하여 진행하였다.
三仁湯(이하 SIT)의 항산화 효능을 평가하기 위해 SIT에 존재하는 총 polyphenol, 총 flavonoid 함량과 DPPH, ABTS radical 소거능을 확인하였다.
폴리페놀(polyphenol)은 식물에서 가장 흔한 2차 대사산물로, 여러 화합물과 쉽게 결합하는 특성을 가진 하이드록실기(-OH)가 다수 존재하여 체내 유해 활성산소를 중화시키고 이를 안정된 물질로 전환시킴으로써 뛰어난 항산화 및 항염, 항바이러스 효과를 나타낸다. 플라보노이드(flavonoid)는 2개의 페닐기가 C3사슬을 매개로 결합하고 있는 가장 흔한 폴리페놀 화합물이며, 히드록실라디칼(･OH)과의 반응성이 매우 높아 세포손상을 일으키는 활성산소종(ROS)을 효과적으로 제거하는 강력한 천연 항산화제로 알려져 있다27. SIT의 총 polyphenol, 총 flavonoid 함량을 측정한 결과, 총 polyphenol은 20.52±0.14 mg GAE/g, 총 flavonoid는 5.93±0.51 mg QE/g으로 나타났다.
DPPH radical, ABTS radical 소거능 측정은 항산화 능력을 평가하는 대표적인 방법으로, DPPH는 free radical이 항산화 활성이 있는 물질과 반응하면 보라색에서 무색으로 변하는 특성을 이용하여, ABTS는 청록색을 띄는 radical이 항산화성 물질에 의해 탈색되어지는 것을 이용하여 항산화 능력을 평가하며, 높은 값일수록 항산화능이 뛰어난 것으로 판단한다28. 본 실험에서 SIT의 DPPH radical과 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, 농도 의존적인 소거능의 증가가 나타났다.
SIT의 농도에 따른 세포 생존율을 측정한 결과, SIT는 50 μg/mL 이상의 농도에서 세포증식이 나타났으며, 400 μg/mL 이상의 농도에서는 90% 이하의 세포 생존율을 보여 본 실험에서는 200 μg/mL 농도까지 진행하였다.
염증은 다양한 병원균들과 생체 이물질들에 의해 면역 세포가 활성화되며, 활성화된 생체 내 염증성 인자들에 의해 cytokine, histamine, prostaglandin, nitric oxide 등의 염증 매개 인자들이 분비된다. 특히 대식세포는 염증 촉진 인자인 NF-κB를 활성화시키며, 그 결과 iNOS와 COX-2를 발현시켜 염증에 관여하는 매개체인 NO와 PGE2를 생성하고, 혈관확장, 발열, 조직손상 등의 염증 반응을 일으키므로 NO, PGE2, pro-inflammatory cytokine은 염증의 지표가 된다1.
이에 본 연구에서는 SIT의 항염증 효과를 평가하기 위해 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포에서의 NO, PGE2, IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성량과 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α의 유전자 및 단백질 발현량을 측정하였다.
NO는 L-arginine을 원료로 하여 NOS(nitric oxide synthase, NO 합성 효소)에 의해 생성되며, 신경전달 및 인체 내 혈압조절뿐만 아니라 면역 과정의 항상성 유지에 중요한 역할을 하고, 감염 시 인체 방어 기전의 핵심이 된다29. 하지만, NO가 필요 이상으로 생성되면 신경 조직의 손상, 과도한 혈관 확장으로 인한 패혈성 쇼크, 항진된 염증 반응 등의 부작용을 일으킨다1. NOS는 eNOS(endothelial NOS), nNOS(neuronal NOS), iNOS(inducible NOS) 3가지의 isoform이 존재하는데, eNOS, nNOS는 일반 세포에서 발현되어 저농도의 NO를 생산하며 세포 내 신호전달 또는 단백질의 활성과 억제에 주로 관여하는 반면, iNOS는 자연 살해 세포, 대식세포, 비만세포, 호산구 등의 면역 세포에서 발현되며, 고농도의 NO를 생산함으로써 선천적 면역에 관여하여 세포 독성 및 염증 반응을 유발한다29.
PGE2는 COX-2에 의해 arachidonic acid로부터 합성되는 PG 중 하나로, 통증, 부종, 발열 등의 염증 반응을 매개한다. COX(cyclooxygenase)는 PG를 합성하는 효소로 COX-1, COX-2 2가지의 isoform이 존재하는데, COX-1은 생리적 호르몬에 의해 조절되며 항상성을 유지시키는 반면, COX-2는 위기상황 시 cytokine 등에 의해 유도되어 염증이나 면역 반응을 일으킨다30.
IL-1β, IL-6, TNF-α는 pro-inflammatory cytokine으로서 급성기 염증 반응 조절 시 중요한 역할을 담당한다. IL-1β는 대식세포 활성화 및 Chemokine 생성 유도를 통해 염증 세포의 침윤을 증가시킨다. IL-6는 B림프구 분화를 통하여 항체 생산 및 분비를 증가시키고, 염증성 질환을 만성화시킨다. TNF-α는 활성화된 대식세포에 의해 염증 발생 초기에 생성 및 분비되며, 감염 시 면역 반응에 있어서 중요한 역할을 한다31.
SIT 투여군의 NO, PGE2, IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성량을 측정한 결과, NO, PGE2, IL-1β, IL-6는 100 μg/mL 이상의 농도에서, TNF-α는 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 또한, iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α의 유전자 발현량을 측정했을 때, IL-6는 50 μg/mL 이상의 농도에서, iNOS, COX-2는 100 μg/mL 이상의 농도에서, IL-1β, TNF-α는 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였으며, iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α의 단백질 발현량을 측정했을 때, COX-2, IL-1β, IL-6는 50 μg/mL 이상의 농도에서, iNOS는 100 μg/mL 이상의 농도에서, TNF-α는 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하여 SIT의 항염증 효과를 확인할 수 있었다.
MAPKs(mitogen activated protein kinases)는 염증 반응의 세포 내 신호 전달체계 중 하나로, 면역 세포의 증식, 분화 및 염증 반응을 조절하고, cytokine과 염증성 매개 물질의 합성에 중요한 역할을 한다32. MAPKs는 ERK(Extracellular signal-regulated kinase), JNK(c-Jun N-terminal kinase) 및 p38 세 가지로 구성되어 있으며, ERK는 성장 인자, 호르몬 등에 의해, JNK와 p38은 염증성 자극, 세포 내 스트레스, 환경적 스트레스 등에 의해 활성화되어 염증 발현을 유도한다33. 즉, 과도한 MAPK 경로의 활성화는 염증성 질환을 발생시키므로 이를 억제하는 것은 염증 완화의 치료적 목표라고 할 수 있다.
ERK, JNK, p38 단백질의 인산화를 측정한 결과, ERK에서는 대조군에 비해 유의적인 변화가 나타나지 않았으며, JNK에서는 50 μg/mL 이상의 농도에서, p38에서는 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이를 통해 SIT가 MAPKs의 활성을 억제함으로써 항염증 효과가 있음을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통해 三仁湯의 항산화 활성 및 염증 반응 개선 효과를 확인할 수 있었고, 이를 토대로 三仁湯이 다양한 염증성 질환의 치료제로서 활용될 수 있을 것으로 사료된다. 다만, 본 실험은 세포 수준(in vitro)에서 시행됐다는 점, 저자의 三仁湯 실험 결과와 기존에 연구되었던 三仁湯을 구성하는 개별 약재들의 항산화 및 항염증에 대한 결과와 실험 방법이 달라 비교 분석이 어려웠다는 점 등의 한계가 있으며, 향후 三仁湯의 in vivo에서의 추가적인 실험 및 충분한 임상 적용 연구가 필요할 것으로 사료된다.
Ⅴ. 결 론
三仁湯(SIT)의 항산화 효능 및 LPS로 염증 유도된 RAW 264.7 대식세포에서의 항염증 효과를 실험한 결과를 토대로, 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. SIT에 존재하는 총 polyphenol과 총 flavonoid 측정값은 각각 20.52±0.14 mg GAE/g, 5.93±0.51 mg QE/g 으로 나타났다.
2. SIT의 DPPH radical과 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, 농도 의존적인 소거능의 증가가 나타났다.
3. SIT의 농도에 따른 세포 생존율을 측정한 결과, 50 μg/mL 이상의 농도에서 세포증식이 나타났으며, 400 μg/mL 이상의 농도에서는 90% 이하의 세포 생존율을 보였다.
4. SIT는 NO, PGE2, IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성량을 대조군에 비해 유의하게 감소시켰다.
5. SIT는 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α의 유전자 및 단백질 발현량을 대조군에 비해 유의하게 감소시켰다.
6. SIT의 단백질 인산화를 측정한 결과, ERK에서는 대조군에 비해 유의적인 변화가 나타나지 않았으며, JNK, p38에서는 대조군에 비해 유의하게 감소하였다.
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