진피와 오수유 복합물이 역류성 식도염 모델에서염증 및 산화적 스트레스 완화에 미치는 영향

Effects of the Combination of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus on Inflammation and Oxidative Stress in a Reflux Esophagitis Model

Article information

J Int Korean Med. 2025;46(4):593-609

Publication date (electronic) : 2025 September 30

doi : https://doi.org/10.22246/jikm.2025.46.4.593

Il-Ha Jeong , Mi-Rae Shin , Min Ju Kim , Hui Yeon An , Seong-Soo Roh

정일하, 신미래, 김민주, 안희연, 노성수

대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실

Dept. of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University

·Corresponding author: Seong-Soo Roh Dept. of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, 1, Hanuidae-ro, Gyeongsan-si, Gyeongsangbuk, Korea Tel: +82-53-819-1545 Fax: +82-53-819-1850 E-mail: ddede@dhu.ac.kr

Received 2025 June 13; Revised 2025 October 4; Accepted 2025 October 4.

Abstract

ABSTRACT

Objective:

Reflux esophagitis (RE) results from backward flow of gastric contents, and conventional treatments often have side-effects. This study investigated the anti-inflammatory and antioxidant effects of a combined extract of Citri unshius pericarpium and Evodiae Fructus (CPE) in an acute RE rat model.

Methods:

Twenty-four rats were divided into four groups. The normal and control groups received distilled water, while the experimental groups received CPE (50 or 100 mg/kg). After 3.5 h, serum reactive oxygen species (ROS), prostaglandin E2 (PGE2), and inflammatory cytokines were measured. Esophageal tissues were analyzed for antioxidant, inflammatory, tight junction (TJ), and extracellular matrix (ECM) proteins.

Results:

CPE reduced ROS, PGE2, and inflammatory cytokine levels; activated the Nrf2 pathway; increased antioxidant enzymes; decreased MAPK, COX-1, and COX-2 expression; and modulated TJ and ECM proteins.

Conclusion:

CPE alleviates esophageal injury by suppressing inflammation and oxidative stress through NF-κB inhibition and Nrf2 activation, highlighting its potential as a natural therapy for RE.

Keywords: Citri unshius pericarpium; Evodiae fructus; acute reflux esophagitis; oxidative stress; antioxidant

Ⅰ. 서 론

위식도 역류 질환(Gastroesophageal reflux disease, GERD)은 위 내용물, 특히 위산과 담즙이 식도로 역류하여 가슴쓰림, 역류감, 흉통 등의 증상을 유발하는 만성적인 소화기 질환이다1. GERD는 상복부 통증, 소화불량, 메스꺼움 등 여러 증상과 관련되며, 특히 만성적인 염증 반응이 지속되면서 식도 점막의 손상과 재구성 과정을 초래한다2. 이 과정에서 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha) 및 기타 염증성 사이토카인의 과발현과 함께, T세포 및 호중구의 조직 내 침윤이 증가하는 경향이 나타난다. 최근 연구에 따르면 GERD 환자에서는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 축적이 증가하고, 이를 조절하는 항산화 방어 체계인 Nrf2 신호 전달 경로가 저하되어 산화적 스트레스가 심화되는 것으로 보고되고 있다. 이로 인해 산화 손상과 염증 반응이 지속적으로 유발되며, 식도 점막의 구조적 손상과 재구성이 함께 진행되는 병태생리가 형성된다3.

식도염은 단순한 소화기 증상에 국한되지 않으며, 환자의 삶의 질을 저하시킬 뿐만 아니라 바렛 식도(Barrett’s esophagus)와 같은 심각한 합병증을 유발할 수 있다. 따라서 위식도 역류 질환은 적절한 치료가 이루어지지 않을 경우 장기적인 합병증을 초래할 수 있는 질환이다4. 현재 위식도 역류 질환의 치료는 주로 약물요법에 의존하고 있으나, 기존 약물들은 주로 위산 분비 억제나 위장운동 촉진에 국한된 작용을 하여 증상 완화에는 일시적인 효과만을 보일 뿐, 식도 점막의 염증이나 산화적 스트레스 등 병태생리적 기전을 직접적으로 조절하지는 못한다5. 예를 들어, 메토클로프라마이드(metoclopramide)나 모사프리드(mosapride)는 위장운동 촉진에는 효과적이지만, 염증 억제나 점막 재생과 같은 근본적인 회복에는 한계가 있다6. 또한, 일부 제산제나 위장운동 촉진제는 장기 복용 시 내성이나 부작용의 우려가 있으며, 이에 따라 보다 안전하고 병태생리 기반의 치료제가 필요한 상황이다.

본 연구에 사용한 진피(Citri unshius pericarpium, CP)는 귤나무 Citrus unshiu Markovich 또는 Citrus reticulata Blanco(Rutaceae)의 잘 익은 열매 껍질로, 에센셜 오일(essential oils), 플라보노이드(flavonoids), 알칼로이드(alkaloids) 및 비타민 C 등을 함유하고 있다7. 진피는 소화 기능 개선, 기혈 순환 촉진, 항산화 및 항염증 작용 등의 다양한 생리활성을 가진 약재로, 특히 소화불량이나 구토 증상의 완화에 전통적으로 활용되어 왔으며, 이러한 효능은 여러 전임상 및 생리활성 관련 연구를 통해 입증되고 있다8,9.

오수유(Evodiae Fructus, EF)는 리그난(lignans), 플라보노이드, 트리테르페노이드(triterpenoids), 유기산(organic acids)등을 함유하고 있으며, 간 보호, 면역력 증진, 항산화 및 항염증 효과등 다양한 약리 활성을 가진 것으로 보고되어 있다10. 오수유는 전통적으로 오랜 기간 한약재로 활용되어 왔으며, 최근에는 식물 유래 항산화 뮬질 및 생리활성 화합물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 성분들은 기능성 식품, 건강 보조제, 그리고 치료제 개발을 위한 유망한 후보물질로 평가받고 있다11.

진피와 오수유는 각각 항산화 및 항염증 특성이 우수한 약용 식물로 알려져 있으며, 복합 투여 시 시너지 효과를 통해 식도 점막 보호 및 염증 억제에 효과적일 것으로 기대된다. 본 연구팀은 선행 연구를 통해 다양한 혼합 약재 중 진피와 오수유의 1:4 배합이 급성 역류성 식도염 동물 모델에서 가장 우수한 치료 효과를 나타낸다는 결과를 보고한 바 있다12. 이에 본 연구에서는 해당 최적 배합 비율을 바탕으로 저농도 및 고농도 투여군을 설정하여, 용량에 따른 항산화 및 항염증 효과를 정량적으로 비교 평가하고, 식물 유래 복합 치료제의 가능성을 검토하고자 한다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재 료

1) 시 료

본 실험에 사용된 진피(陳皮, Citri Unshius Pericarpium)와 오수유(吳茱萸, Evodiae Fructus)는 옹기한약국(Korea)에서 구매하였다. 각각 한약재 100 g에 증류수 1,000 mL를 첨가하여, 열탕 추출기(Daewoong Bio, Seoul, Korea)를 사용하여 2시간 동안 추출을 진행하였다. 추출액은 여과한 뒤, 회전 감압 농축 장치(Buchi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)를 사용하여 농축하였고, 동결건조기(Ilshin, Seoul, Korea)를 이용해 완전히 건조하여 분말형태로 제조하였다. 진피와 오수유는 본 연구의 선행 실험을 통해 도출된 최적 배합비(1:4)를 적용하였으며, 투여 직전에 혼합하여 실험에 사용하였다. 복합 추출물은 “CPE”라는 약어로 표기하였다. 진피와 오수유 각각의 수율은 21% 및 14%로 나타났다.

2) 실험 시약

1,1,3,3-tetramethoxypropane, 2-thiobarbituric acid, 2’,7’-dichlorofluoresce in diacetate(DCFDA), sodium phosphate monobasic, sodium phosphate dibasic, potassium chloride(KCl), glycerol은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Sodium carbonate와 potassium acetate는 Daejung Chemicals & Metals CO. Ltd.(Gyeonggi, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Bicinchoninic acid(BCA) Protein assay kit는 Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA, USA)에서 구입하여 단백질 정량에 사용하였다. 1차 항체인 LaminB1, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), keap1, heme oxygenase-1 (HO-1), c-Jun N-terminal kinase(JNK) phospho-c-Jun N-terminal Kinase(p-JNK), extracellular signal-regulated kinase(ERK), phospho-extracellular signal-regulated kinase(p-ERK), nuclear factor-kappa B p65 (NF-κBp65), cyclooxygenase-1(COX-1), cyclooxygenase-2 (COX-2), zonula occludens-1(ZO-1), occludin, claudin-1, claudin-4, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), matrix metalloproteinase-9(MMP-9), tissue inhibitor of metalloproteinases-1(TIMP-1), tissue inhibitor of metalloproteinases-2(TIMP-2)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Dallas, TX, USA)에서, inducible nitric oxide synthase(iNOS)는 Cell Signaling Technology, Inc.(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 2차 항체는 GeneTex, Inc.(Irvine, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Protease inhibitor mixture는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)에서, nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare(Little Chalfont, Bucks, UK)에서 구입하였다. Enhanced Chemiluminescence (ECL) Western Blotting Detection Reagents는 GE Healthcare(Chicago, IL, USA)로부터 구입하였다.

2. 방 법

1) 급성 역류성 식도염 동물 실험 유발 및 약물 투여

본 실험에 사용된 6주령 Sprague-Dawley(SD) 수컷 쥐를 DBL Co., Ltd.(Eumseong, Korea)에서 구입하였으며, 표준 동물 사욕 환경에서 사육하였다. 동물 사육실의 온도는 22±2℃, 습도는 50±5%로 유지되었으며, 명암 주기는 12시간 주기로 조절하였다. 본 실험은 대구한의대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)로부터 실험의 윤리성 과학적 타당성에 대한 승인(승인번호: DHU2023-046)을 받아 진행하였다.

실험은 총 4군으로 나누어 진행되었으며, 각 군에는 5마리의 쥐가 포함되었다. 정상군(Normal), 급성 역류성 식도염을 유발한 대조군(Control), 급성 역류성 식도염을 유발하기 전 CPE 50 mg/kg를 투여한 군(CPE50), 그리고 급성 역류성 식도염을 유발하기 전 CPE 100 mg/kg를 투여한 군(CPE100)로 나누었다. 급성 역류성 식도염(reflux esophagitis, RE)을 유발하기 위해, 수술 전 18시간 동안 절식을 시행하였다. 수술 당일 각 시료를 증류수에 녹여 경구 투여한 뒤 1시간 후, isoflurane(Wellona Pharma, India)을 이용해 흡입 마취를 실시하였다. 이후 복부에 약 2 cm 정도 절개를 가한 뒤, 위저부 및 날문부를 2-0 실크 실로 결찰하고, 복막과 피부를 봉합하였다. 수술 후 3.5시간이 경과한 시점에 복대정맥에서 혈액을 채취하고, 식도 조직을 적출하였다. 채취한 혈액은 4 ℃에서 1,508×g로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였으며, 혈청과 식도 조직은 -80 ℃에서 보관하여 실험에 사용하였다.

2) 식도 점막 손상도 측정

적출한 식도 조직은 광학 디지털 카메라(DSCHX50V; Sony, Tokyo, Japan)로 촬영하였으며, 손상된 식도 점막의 면적은 I-Solution lite 프로그램(Innerview Co., Gyeonggi-do, Korea)을 사용하여 측정하였다. 식도 전체 면적과 손상 부위를 각각 측정한 후, 이를 기반으로 손상 비율(%)을 다음과 같이 계산하였다.

육안적 점막 손상 비율(%)=(식도 점막 손상 부위의 면적(mm²)/식도의 전체 면적(mm²))×100

3) 조직 병리학적 분석

적출한 식도 조직은 먼저 10% 포르말린에 3일간 고정한 후, 표준 조직 염색법인 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색을 시행하였다. 염색이 완료된 조직은 광학 현미경(DSCHX50V, Sony, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였으며, 이를 통해 식도 조직에서 나타나는 병리적 변화 및 이상 유무를 평가하였다.

4) 혈액 내 ROS와 PGE₂ 측정

혈액 내 reactive oxygen species(ROS)의 변화를 측정하기 위해 Ali등(1992)의 방법을 적용하였다13. Black 96-well plate에 혈청 5 μL와 50 mM phosphate buffer 95 μL를 혼합한 후, 1.25 mM 2’,7’-Dichlorofluorescein diacetate(DCFDA) 25 μL를 첨가하여 반응시켰다. 이후 0분부터 매 5분씩 간격으로 형광값을 측정하였으며, 형광 변화는 microplate reader(Infinite F200; Tecan Group Ltd., Männedorf, Switzerland)를 이용하여 excitation 485 nm, emission 530 nm 조건에서 측정하였다. 측정된 형광값은 정상군 대비값(fold of Normal)으로 계산하였다. 한편, 혈청 내 prostaglandin E₂(PGE₂)의 농도는(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)에서 제공한 실험 방법에 따라 분석하였다. PGE₂의 흡광도는 microplate reader(Infinite M200; Tecan Group Ltd., Männedorf, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.

5) 혈액 내 염증성 사이토카인 측정

혈액 내 tumor necrosis factor-α(TNF-α)와 interleukin-6(IL-6) 농도는 ELISA Kit(Koma Biotech, Seoul, Korea)를 사용하여 분석하였다. 표준 물질 및 혈청 시료 각각 100 μL를 96-well plate에 첨가한 후, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료 된 후, 각 well을 세척하고, 검출 항체 100 μL 첨가하여 다시 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후 well을 세척한 뒤, streptavidin-horseradish peroxidase(HRP) 100 μL 첨가하고 20분간 반응시켰다. 다음으로, 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine(TMB) 용액 100 μL 를 첨가하여 실온에서 반응시켰으며, 반응 종료 시 정지 용액을 첨가하여 반응을 종료하였다. 최종적으로, microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

6) 식도 조직 western blotting

식도 조직에서 세포질을 분리하기 위해, buffer A [10 mM HEPES(pH 7.8), 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, protease inhibitor cocktail]에 현탁한 뒤, 조직분쇄기(Biospec Products, Oklahoma, USA)를 이용해 균질화하였다. 균질화된 시료는 얼음 위에서 30분간 반응시킨 후, 10% NP-40 용액을 첨가하고 4 ℃에서 1,508×g 으로 2분간 원심분리하여 상층액을 수거하여 세포질을 얻었다. 남은 pellet은 10% NP-40이 포함된 buffer로 두 번 세척한 뒤, 핵 단백질을 분리하기 위해 buffer C [50 mM HEPES(pH 7.8), 300 mM NaCl, 50 mM KCl, 1% glycerol, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF]를 첨가하여 10분 간격으로 총 3회 vortex하였다. 이후 상층액을 수거하여 핵을 확보하였다. 분리된 세포질 및 핵 단백질의 발현 분석을 위해, 각 시료에서 12 μg의 단백질을 8-12% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동한 후, nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이시켰다. 1차 항체는 1:1,000 비율로 희석하여 4 ℃에서 overnight incubation하였으며, 이후 PBS-T로 세척하였다. 2차 항체는 PBS-T에 1:3,000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 동일한 방법으로 세척하였다. 단백질 발현은 ECL 시약을 사용해 Vilber Fusion Solo X(Vilber Lourmat, Marne LaVallee, France)으로 검출하였으며, 밴드의 상대적 발현량을 분석하였다. 결과 분석은 Evolution Capt Edge software(Vilber Lourmat)를 이용하였다.

7) 통계분석

모든 실험 결과는 평균±표준오차(mean±standard error of the mean, SEM)로 나타내었으며, 통계 분석은 SPSS 소프트웨어(Version 26.0; IBM, Armonk, NY, USA)를 사용하여 수행하였다. 군 간 평균의 차이는 일원분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)으로 검정하였고, 사후 분석으로는 최소유의차(least significant difference, LSD) 검정을 적용하였다. 통계적 유의성은 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 수준에서 판단하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 식도 점막 손상도 측정결과

식도 점막의 손상 정도를 육안으로 관찰한 결과, Normal군에서는 손상이 관찰되지 않았다. 급성 역류성 식도염을 유발한 Control군에서는 식도 전체에 걸쳐 식도 상피의 두께가 증가하고, 손상 범위가 전반에 걸쳐 광범위하게 나타났다. Normal군 대비 Control군에서는 손상 면적 비율이 50.7±3.3로 유의하게 증가하였다(p<0.001). 또한, CPE50군에서는 43.5±1.1(p<0.05), CPE100군은 32.1±1.3(p<0.001)로, Control군에 비해 식도 점막 손상이 유의성 있게 감소하였다(Fig. 1).

Fig. 1

The effect of CPE on gross morphology following surgical induction of acute reflux esophagitis.

(A) Representative images of reflux esophagitis. (B) Gross mucosal injury ratio. All data are expressed as means±SEM (n=5). Normal : normal rats, Control : acute reflux esophagitis rats, CPE50 : CPE 50 mg/kg orally treated rats, CPE100 : CPE 100 mg/kg orally treated rats. Significance : ^###p<0.001 vs. Normal, *p<0.05, ***p<0.001 vs. Control. CPE, a combined extract of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus.

2. 조직 병리학적 분석 결과

급성 역류성 식도염을 유도한 후 식도 조직에 대한 병리조직학적 관찰 결과, Normal군에서는 식도 점막 구조가 보존되어 있었으며, 염증 소견이나 구조적 이상이 관찰되지 않았다. 반면, Control군에서는 식도 전반에 걸쳐 상피세포 탈락, 점막 손상, 점막하층의 부종 및 혈전 형성이 현저하게 나타났다. CPE50군과 CPE100군에서는 이러한 병리적 변화가 뚜렷하게 감소하였으며, 상피층의 보존 정도와 점막하 부종이 개선된 양상을 보였다(Fig. 2).

Fig. 2

Esophageal histological examination through hematoxylin and eosin staining (magnification×200).

Normal : normal rats, Control : acute reflux esophagitis rats, CPE50 : CPE 50 mg/kg orally treated rats, CPE100 : CPE 100 mg/kg orally treated rats. CPE, a combined extract of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus.

3. 혈액 내 ROS와 PGE2 분석 결과

혈액 내 ROS 분석 결과, Normal군에 비해 Control군에서는 ROS 수치가 263.7±5.1로 유의하게 증가하였다(p<0.001). 반면, CPE50군과 CPE100군에서는 각각 231.9±5.4(p<0.05) 및 193.3±16.9 (p<0.001)로 감소하여, Control군 대비 각각 12.1%, 26.7%의 감소하였다.

또한, 역류성 식도염에서 점막 손상 및 염증 반응을 유발하는 주요 매개체인 PGE₂ 농도는 Normal군에서 568.3±106.9 pg/mL였던 반면, Control군에서는 3071.9±363.0 pg/mL로 약 5.4배로 유의하게 증가하였다(p<0.001). CPE50군은 2007.1±465.3 pg/mL (p<0.05)로 Control군 대비 34.7% 감소하였으며, CPE100군에서는 1049.2±215.9 pg/mL(p<0.001)로 65.8% 유의하게 감소하였다. 특히, CPE100군에서는 과도하게 증가한 PGE₂의 발현을 유의성 있게 감소하였다(Fig. 3).

Fig. 3

Effect of CPE on serum ROS and PGE2 levels in acute reflux esophagitis.

All data are expressed as mean±SEM (n=5). Normal : normal rats, Control : acute reflux esophagitis rats, CPE50 : CPE 50 mg/kg orally treated rats, CPE100 : CPE 100 mg/kg orally treated rats. Significance : ^###p<0.001 vs. Normal, *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 vs. Control. CPE, a combined extract of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus.

4. 혈액 내 염증성 사이토카인 분석 결과

혈액 내 TNF-α 농도는 Normal군에서 1938.1±42.8 pg/mL였고, Control군에서 2256.4±22.0 pg/mL로 1.2배로 증가하였다(p<0.01). CPE50군은 2077.2±50.5 pg/mL(p<0.05), CPE100군은 2007.5±82.8 pg/mL (p<0.01)로, 고농도 처리군에서 가장 유의미한 감소를 보였다. IL-6 농도는 Normal군에서 191.6±3.3 pg/mL였고, Control군에서 259.4±12.5로 1.4배 증가하였다(p<0.05). CPE50군은 195.7±40.6 pg/mL(p<0.05), CPE100군은 190.1±14.5 pg/mL(p<0.05)로 각각 24.5%, 26.7% 감소하였다(Fig. 4).

Fig. 4

Effect of CPE on serum TNF-α and IL-6 levels in acute reflux esophagitis.

All data are expressed as mean±SEM (n=5). Normal : normal rats, Control : acute reflux esophagitis rats, CPE50 : CPE 50 mg/kg orally treated rats, CPE100 : CPE 100 mg/kg orally treated rats. Significance : ^#p<0.05, ^##p<0.01 vs. Normal, *p<0.05, **p<0.01 vs. Control. CPE, a combined extract of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus.

5. 조직 내 항산화 단백질 분석 결과

Nrf2는 세포에서 산화적 스트레스에 관여하는 방어시스템을 조절하며, 염증을 유발하는 사이토카인 및 화학물질의 발현을 억제해 염증 반응을 완화하는 데 기여한다14. 식도 점막의 보호 및 회복을 돕는 Nrf2의 단백질 발현량을 분석한 결과, Normal군 대비 Control군에서 발현량이 49.8% 감소한 반면, Control군 대비 CPE50군은 1.1배, CPE100군은 1.9배 증가하였다(p<0.01). Keap1은 Nrf2 전사 인자와 결합하여, 산화적 스트레스에 대한 세포 반응을 억제하는 역할을 한다. 본 연구에서는 이 Keap1 단백질의 발현량을 분석한 결과, Normal군 대비 Control군은 59.0%(p<0.01) 증가하였으며, Control군 대비 CPE50군과 CPE100군은 각각 50%(p<0.001), 48.6%(p<0.01)감소하였다. HO-1 단백질은 Normal군 대비 Control군에서 55.8% (p<0.01) 감소하였으며, CPE50군과 CPE100군은 Control군 대비 각각 1.3배, 2.0배(p<0.01)증가하였다. SOD-1의 단백질 발현량은 Normal군 대비 Control군에서 34.8%(p<0.05)감소하였으며, Control군 대비 CPE50군과 CPE100군은 각각 1.5배(p<0.05), 1.6배(p<0.05)증가하였다(Fig. 5).

Fig. 5

Effect of CPE on the expression of antioxidant proteins (Nrf2, Keap1, HO-1, and SOD-1) in esophageal tissue in acute reflux esophagitis.

All data are expressed as mean±SEM (n=5). Normal : normal rats, Control : acute reflux esophagitis rats, CPE50 : CPE 50 mg/kg orally treated rats, CPE100 : CPE 100 mg/kg orally treated rats. Significance : ^#p<0.05, ^##p<0.01 vs. Normal, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control. CPE, a combined extract of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus.

6. 조직 내 MAPK kinases 단백질 발현량 분석

MAPK (mitogen-activated protein kinases) 경로는 세포 외부 자극에 대한 반응으로 염증, 세포 증식, 세포사멸 등을 조절하는 중요한 신호 전달 체계이다. 이 경로의 핵심 인자인 p-JNK의 발현량을 분석한 결과, Normal군 대비 Control군에서 2.4배(p<0.001) 증가한 반면, Control군 대비 CPE50군은 24.1%(p<0.01), CPE100군은 26.2%(p<0.001) 감소하였다. p-ERK의 단백질 발현량은 Normal군 대비 Control군에서 5.2배(p<0.001)로 유의미하게 증가했으며, Control군 대비 CPE50군에서 14.6%, CPE100군에서 22.4%(p<0.05) 감소하였다(Fig. 6).

Fig. 6

Effect of CPE on the expression of MAPK pathway proteins（p-JNK, p-ERK）in esophageal tissue in acute reflux esophagitis.

All data are expressed as mean±SEM (n=5). Normal : normal rats, Control : acute reflux esophagitis rats, CPE50 : CPE 50 mg/kg orally treated rats, CPE100 : CPE 100 mg/kg orally treated rats. Significance : ^###p<0.001 vs. Normal, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control. CPE, a combined extract of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus.

7. 조직 내 염증성 단백질 분석

(1) 염증성 단백질 분석

식도 조직 내에서 NF-κBp65의 단백질 발현량은 Normal군에 비해 Control군에서 2.9배(p<0.001) 증가하였다. 그러나 CPE50군에서는 Control군 대비 31.0%(p<0.01), CPE100군은 37.6%(p<0.01) 유의하게 감소하였다. iNOS의 단백질 발현량은 Control군에서 Normal군 대비 1.7배(p<0.001) 증가하였으며, CPE50군은 36.5%(p<0.05), CPE100군은 37.6% (p<0.05) 감소하였다. TNF-α의 단백질 발현량은 Control군에서 Normal군 대비 2.1배(p<0.001) 증가하였고, CPE50군은 29.2%(p<0.05), CPE100군은 38.4%(p<0.01) 감소하였다. 또한, IL-6의 단백질 발현량은 Control군에서 Normal군 대비 2.2배(p<0.001) 증가하였으며, CPE50군은 37.7% (p<0.001), CP100군은 50.3%(p<0.001) 유의하게 감소하였다. 특히, CPE100군에서 IL-6의 발현 억제 효과가 가장 뚜렷하게 나타났다(Fig. 7).

Fig. 7

Effect of CPE on inflammation markers in esophageal tissue of acute reflux esophagitis.

All data are expressed as mean±SEM (n=5). Normal; normal rats, Control; acute reflux esophagitis rats, CPE50; CPE 50 mg/kg orally treated rats, CPE100; CPE 100 mg/kg orally treated rats. Significance: ^###p<0.001 vs. Normal, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control. CPE, a combined extract of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus.

(2) COX-1과 COX-2의 단백질 발현량 분석

식도 조직에서의 COX-1과 COX-2는 모두 염증 반응에 관여하는 효소이지만, 기능과 발현 양상에 있어 뚜렷한 차이를 보인다. COX-1은 항상성 유지에 필요한 기저 수준의 효소로, 위 점막 보호와 같은 생리적 기능을 담당하는 반면, COX-2는 주로 염증 자극에 의해 유도되며, 염증 매개물질인 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생성을 증가시킨다. 따라서, 이들 효소의 발현 변화는 GERD와 같은 식도 염증 질환의 병태생리를 이해하고, 항염증 치료제의 작용 기전을 평가하는 데 중요한 지표로 활용된다. 본 실험에서 COX-1의 단백질 발현량을 분석한 결과, Control군에서는 Normal군에 비해 31.9%(p<0.05) 감소하였으며, Control군 대비 CPE50군은 1.4배(p<0.05), CPE100군은 1.51배(p<0.01) 증가하였다. 반면 COX-2의 발현량은 Control군에서 Normal군에 비해 1.6배(p<0.001) 증가하였으며, Control군 대비 CPE50군 및 CPE100군은 각각 22.5%(p<0.01), 21.6%(p<0.01) 유의하게 감소했다(Fig. 8). 이러한 결과는 CPE 복합물이 COX 효소의 발현을 조절함으로써 식도 염증 반응을 완화하는 데 기여할 수 있음을 시사 한다.

Fig. 8

Effect of CPE on expression of COX-1 and COX-2 in esophageal tissue of acute reflux esophagitis.

All data are expressed as mean±SEM (n=5). Normal : normal rats, Control : acute reflux esophagitis rats, CPE50 : CPE 50 mg/kg orally treated rats, CPE100 : CPE 100 mg/kg orally treated rats. Significance : ^#p<0.05, ^###p<0.001 vs. Normal, *p<0.05, **p<0.01 vs. Control. CPE, a combined extract of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus.

8. Tight Junction 단백질 발현량 분석

Tight junction은 상피세포 간의 밀착 부위로, 장벽(barrier) 기능을 수행하여 외부 자극이나 병원체, 독성 물질이 세포 간극을 통해 조직 내부로 침투하는 것을 방지한다. 주로 ZO-1, occludin, claudin과 같은 단백질들로 구성되어 있으며, 이들은 세포 극성 유지와 선택적 투과성 조절에 핵심적인 역할을 한다. 본 연구에서는 tight junction 관련 단백질들의 발현 변화를 분석하였다. ZO-1 단백질의 경우, Control군에서는 Normal군에 비해 37.7% 유의하게 감소하였으며(p<0.01), CPE50군과 CPE100군에서는 Control군 대비 각각 1.2배 및 1.6배 증가하였다(p<0.01). Occludin의 발현량은 Normal군 대비 Control군에서 9.2% 감소하였고(p<0.05), CPE50군 및 CPE100군에서는 Control군 대비 각각 1.2배(p<0.05) 및 1.3배(p<0.01) 증가하였다. Claudin-1은 Control군에서 Normal군에 비해 41.3% 유의하게 감소하였으며(p<0.001), CPE50군 및 CPE100군에서는 Control군 대비 각각 1.4배(p<0.01), 1.5배(p<0.001) 증가하였다. Claudin-4 의 발현량은 Normal군 대비 Control군에서 32.1%(p<0.01) 감소하였고, CPE50군과 CPE100군에서는 Control군 대비 각각 1.1배 및 1.4배(p<0.05)로 유의하게 증가하였다(Fig. 9). 이러한 결과는 CPE 복합물이 tight junction 관련 단백질의 발현을 회복시켜, 손상된 식도 점막의 장벽 기능을 개선하는 데 기여할 수 있음을 시사한다.

Fig. 9

Effect of CPE on the expression of inflammation markers in esophageal tissue in acute reflux esophagitis.

All data are expressed as mean±SEM (n=5). Normal : normal rats, Control : acute reflux esophagitis rats, CPE50 : CPE 50 mg/kg orally treated rats, CPE100 : CPE 100 mg/kg orally treated rats. Significance : ^#p<0.05, ^##p<0.01, ^###p<0.001 vs. Normal, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control. CPE, a combined extract of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus.

9. 세포 외 기질 단백질 발현량 분석

세포외기질(Extracellular Matrix, ECM)은 식도 상피세포의 구조적 안정성과 기능적 항상성을 유지하는 데 핵심적인 역할을 하며, 세포 재생 및 손상 치유 과정에서도 다양한 생리적 신호를 전달한다15. 본 연구에서는 ECM의 항상성 유지 및 재구성에 관여하는 주요 조절 인자인 MMP-2와 MMP-9(ECM 분해 효소), 그리고 이들의 활성을 억제하는 TIMP-1 및 TIMP-2의 단백질 발현 변화를 분석하였다. MMP-2 발현량은 Control군에서 Normal군 대비 1.5배(p<0.01) 유의하게 증가하였으며. CPE50군 및 CPE100군에서는 Control군 대비 각각 37.2%(p<0.01), 29.4%(p<0.01) 감소하였다. MMP-9의 경우, Control군에서 Normal군에 비해 2배(p<0.001) 유의하게 증가하였고, CPE50군과 CPE100군에서는 Control군 대비 각각 27.5%(p<0.01), 44.7%(p<0.001) 감소하였다. 한편, ECM 분해를 억제하고 조직 손상을 제한하는 역할을 하는 TIMP-1과 TIMP-2의 단백질 발현량은 Control군에서 Normal군 대비 각각 37.7%(p<0.01), 54.1%(p<0.01)으로 유의하게 감소하였다. 반면, CPE50군에서는 TIMP-1과 TIMP-2가 Control군 대비 각각 1.2배 및 1.5배(p<0.05) 증가하였고, CPE100군에서는 Control군 대비 각각 1.6배 1.8배(p<0.01) 증가하였다(Fig. 10). 본 결과에서는 TIMP-1에서 유의성 있는 결과를 얻지 못하였으나, TIMP-2에서 유의한 증가를 확인하였다. 이는 CPE 복합물이 MMP 및 TIMP-2의 발현 조절을 통해 ECM의 구조적 안정성과 기능적 균형을 유지하며, 식도 조직 손상의 완화에 기여할 수 있음을 시사한다.

Fig. 10

Effect of CPE on the expression of matrix metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-1 and TIMP-2) in esophageal tissue in acute reflux esophagitis.

All data are expressed as mean±SEM (n=5). Normal : normal rats, Control : acute reflux esophagitis rats, CPE50 : CPE 50 mg/kg orally treated rats, CPE100 : CPE 100 mg/kg orally treated rats. Significance : ^##p<0.01, ^###p<0.001vs. Normal, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control. CPE, a combined extract of Citri Unshius Pericarpium and Evodiae Fructus.

Ⅳ. 고 찰

위식도 역류 질환(GERD)은 하부 식도 괄약근 기능의 저하로 인해 위산 및 소화액이 식도로 역류하면서 발생하며, 이로 인해 식도 점막이 반복적으로 손상되고, 장기적으로 바렛 식도, 식도 협착, 궤양, 식도암 등 다양한 합병증을 유발할 수 있다16. 현재까지 GERD 치료에는 위산 분비 억제제(proton pump inhibitor, PPI), H2 수용체 길항제(H2 receptor antagonist) 등이 사용되고 있으나, 장기 복용 시 내성 발생, 위장관 감염 증가, 마그네슘 결핍 등의 부작용이 보고되고 있어, 이에 따라 안전하고 효과적인 대체 치료제에 대한 필요성이 대두되고 있다17,18. 본 연구에서는 항염증 및 항산화 효과가 알려진 진피와 오수유의 복합물(CPE)이 급성 역류성 식도염 동물 모델에서 어떤 생리활성을 나타내는지 분석하였다. 실험 결과, CPE군은 Control군에 비해 식도 점막의 손상을 유의하게 억제하였으며, 육안적 관찰뿐만 아니라 생화학적 지표에서도 뚜렷한 개선 효과를 나타냈다. 특히 조직 내에서 증가한 ROS, PGE₂, TNF-α, IL-6 등 주요 염증 및 산화적 스트레스 관련 인자들의 수치가 CPE 투여로 유의하게 감소하였다.

활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 조직 손상 이후 급격히 생성되어 염증 반응을 유도하고, 세포 내 신호전달 경로를 통해 다양한 염증 매개체의 발현을 조절한다19. 본 연구에서는 CPE 투여에 의해 ROS 생성이 억제되었으며, 이는 항산화 반응을 유도하는 Nrf2 경로의 활성화에 기여하는 것으로 판단된다. Nrf2는 발암 과정과 ROS에 대응하는 전사 인자로 작용하는데, GERD에서 위산과 담즙산 등의 역류로 인해 산화적 스트레스가 증가하면, 세포는 이에 대응하기 위해 Nrf2 신호 경로를 활성화 한다20. Nrf2는 산화적 스트레스에 반응하여 세포핵으로 이동한 후, antioxidant response element(ARE)에 결합해 항산화 효소의 발현을 유도함으로써 세포 보호 기능을 수행한다21,22. 이러한 기전은 세포의 염증 상태 조절과 회복 과정에 중요한 역할을 하며, 본 연구에서도 CPE에 의해 Nrf2의 조절 효과가 간접적으로 확인되었다. 이와 같이 급성 역류성 식도염에 노출될 경우, 심각한 식도염이 발생하며, 역류성 식도염 동물 모델에서는 NF-κB, IL-6, TNF-α 등 다양한 염증 관련 유전자의 상피세포 내 mRNA 발현과 혈중 농도가 모두 증가하는 것으로 나타난다. 이러한 전염증성 사이토카인들은 NF-κB의 활성화 및 MAPK 경로와 같은 주요 염증 신호 전달 과정에 관여하며, 식도 관련 질환의 발병과 진행에 핵심적인 역할을 한다23.

한편, 사이클로옥시나제(Cyclooxygenase, COX) 효소와 그 산물인 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)는 염증 초기의 주요 조절 인자로 알려져 있다24. COX에는 COX-1과 COX-2라는 두 가지 동형이 존재하는데, COX-1은 대부분의 조직에서 항상성 유지를 위해 지속적으로 발현되는 반면, COX-2는 평상시에는 거의 발현되지 않다가 염증성 자극(예: 내독소, 사이토카인, 성장 인자 등)에 의해 유도된다25. 특히, PGE₂는 염증 반응의 주요 특징인 발적, 부종, 발열, 통증 등을 매개하는 강력한 전염증성 인자로 작용하며, 상피세포의 증식과 이동, 혈관 긴장도 조절, 국소 혈류 증가, 혈관 투과성 변화 및 혈관 신생 촉진 등 다양한 생리 기능을 통해 상처 치유에 핵심적으로 기여한다26. 본 연구 결과, CPE 투여는 COX-2의 발현을 억제하고 PGE₂의 생성을 감소시킴으로써 염증 반응을 효과적으로 완화시키는 것으로 나타났다. 본 연구에서는 CPE 투여 시 COX-2의 발현이 억제되고, COX-1의 발현은 유지되거나 회복에 기여하는 것으로 나타났다. 이는 CPE가 일반적인 소염제와는 달리 COX-1의 생리적 기능은 보존하면서 COX-2만을 선택적으로 조절할 수 있음을 시사한다.

GERD의 병리 기전에서 핵심적인 요소 중 하나는 상피 장벽 기능의 손상이며, 이는 tight junction (TJ) 단백질의 구조적 변화 및 발현 감소로 인해 식도 점막의 투과성이 증가하고, 그 결과 염증 반응이 더욱 악화되는 것으로 보고되어 있다27,28. 주요 TJ 단백질들이 상호 보완적으로 작용하여 세포 간 접합을 유지하며, 이 중 원섬유 부위에 주로 존재하는 occludin은 세포 간 결합 안정성뿐만 아니라 신호 전달 경로 조절에도 관여하는 것으로 알려져 있다29. ZO-1은 TJ 단백질들과 세포 골격 사이를 연결하는 매개체로 작용하여, TJ 구조의 안정성과 세포 간 결합 유지에 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되어 있다30,31. 본 연구에서는 역류성 식도염 초기 단계에서부터 위산 등 역류 자극이 claudin-1과 occludin의 구조적 손상을 유발하고, 이로 인해 ZO-1이 claudin-1과의 결합을 유지하지 못하고 TJ 복합체의 재배치와 기능 저하가 초래되는 것으로 나타났다. 그러나 CPE군에서는 이들 단백질의 발현이 회복되어 상피 장벽 기능이 개선되는 결과를 보였다. 뿐만 아니라, 식도 점막 손상의 중요한 병리학적 요인 중 하나는 ECM의 분해와 재형성 불균형이다. Matrix metalloproteinases(MMPs) 계열은 ECM 성분인 콜라겐 등의 분해를 매개하며, 특히 MMP-2와 MMP-9는 염증 환경에서 과도하게 발현되어 조직 손상을 가속화한다32. 이에 반해, 이들의 활성을 억제하는 조직 억제인자인 TIMP-1과 TIMP-9는 MMP의 활성을 조절함으로써 ECM의 안정성을 유지하는데 기여한다. 역류성 식도염의 병리적 상황에서는 위산 및 담즙산 등의 역류 자극으로 인해 식도 점막이 손상되며, 이에 반응하여 MMP-2의 발현이 증가한다33. 이로 인해 ECM의 주성분인 콜라겐이 과도하게 분해되며, 조직 구조의 붕괴와 상피세포의 손상이 가속화된다34. 반면, TIMP-1과 TIMP-2의 발현은 감소하거나 불균형하게 조절되어, MMPs의 활성을 효과적으로 억제하지 못하게 된다. 그 결과, ECM의 과도한 분해가 지속되며 식도 점막의 회복이 지연되고, 만성적인 염증 상태가 유지될 수 있다35. 본 연구에서는 CPE의 투여가 MMP-2의 발현을 억제하고 TIMP-1 및 TIMP-2의 발현을 유도함으로써 ECM의 안정성을 회복시키고 조직 구조의 손상을 완화하는 효과가 있음을 확인하였다.

결론적으로, 본 연구에서는 CPE가 다양한 분자적 기전을 통해 식도 점막 손상을 억제하고, 염증 및 산화적 스트레스로부터 조직을 보호할 수 있는 생리활성 물질임을 보여준다. 이러한 특성은 CPE가 GERD 예방 및 보조 치료제로 활용될 수 있는 가능성을 시사한다.

Ⅴ. 결 론

본 연구는 급성 역류성 식도염 동물 모델에서 진피와 오수유를 복합한 추출물(CPE)를 투여한 결과, 다음과 같은 결론을 도출하였다. 급성 역류성 식도염이 유도된 Control군에서는 식도 점막의 심각한 손상이 관찰되었으나. CPE를 투여한 실험군에서는 산화적 스트레스 및 염증 반응과 관련된 인자들이 유의하게 감소하여 병용 투여에 따를 보호 효과를 확인할 수 있었다.

1. CPE 투여는 식도 점막의 손상을 유의하게 감소시켰으며, 특히 고농도 CPE 투여군에서 가장 뚜렷한 보호 효과를 보였다.

2. 혈중 ROS 및 PGE₂ 농도는 Control군에서 유의하게 증가했으나, CPE 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하였으며, 이는 CPE의 항산화 및 항염 효과를 시사한다.

3. 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 발현은 역류성 식도염 유도에 따라 상승하였으며, CPE 투여 시 유의하게 감소하였다.

4. Control군에서 감소한 Nrf2 및 관련 항산화 단백질의 발현은 CPE 투여에 의해 회복되었으며, 특히 고농도군에서 뚜렷한 증가가 확인되어 산화적 스트레스 완화에 기여하였다.

5. 역류성 식도염으로 활성화된 MAPK 신호 전달 단백질의 발현이 CPE 처리에 따라 억제되었으며, 세포 손상관 관련된 신호 조절 경로에 긍정적인 영향을 미친 것으로 판단된다.

6. CPE 복합물은 염증 관련 인자인 NF-κB, iNOS, TNF-α, IL-6 등의 발현을 억제하고, COX-1과 COX-2의 조절을 통해 염증 완화에 기여하였다.

7. 역류로 인해 손상된 TJ 단백질(claudin-1, occludin, ZO-1)의 발현이 CPE 투여 후 회복되어, 식도 장벽 기능 개선에 기여하였다.

8. ECM 분해 효소인 MMP-2와 MMP-9의 발현은 Control군에서 증가하였으나, CPE 투여 시 유의하게 감소하였고, 동시에 억제 인자인 TIMP-2의 발현을 증가하여 ECM 구조 안정성과 점막 보호에 기여한 것으로 판단된다.

이상의 결과를 종합할 때, CPE는 급성 역류성 식도염에서 염증 및 산화적 스트레스를 억제하고, 식도 점막 손상을 완화하는 다중 생리활성을 통해 치료 및 보조 치료제로서의 가능성을 제시하였다. 다만, 본 연구는 급성 동물 모델을 기반으로 하여 장기적인 효과나 약물 대조군의 검토가 필요하므로 향후 만성 모델 및 임상 연구를 통한 추가 검증이 필요합니다.

감사의 글

본 연구는 한국 정부(MSIT)의 지원을 받은 한국연구재단(NRF) 보조금(번호:RS-2022-NR068894)을 통해 수행되었다.

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